RT-PCR을 통한 COVID-19 테스트를 위한 바이러스 수송 매체 없이 자가 수집한 타액 샘플

이것은 자체 수집한 타액을 표본으로 사용하여 Eppendorf Thermal Cycler PCR 시스템에서 SARS-CoV-2를 검출하는 절차를 검증하기 위한 기술 연구입니다. 조사관은 자체 수집한 타액 샘플(Eppendorf Thermal Cycler PCR 시스템에서 평가)과 의료진이 수집한 비인두 샘플 간의 일치율 및 95% 신뢰 구간(즉, 전체 일치율, 양성 일치율 및 음성 일치율)을 계산합니다. (BioFire® FilmArray® Torch® 시스템 또는 Cepheid® GeneXpert®에서 금본위제로 평가됨). 타액 및 비인두 방법 모두에 대해 유용한 결과가 없는 참가자는 분석에 포함되지 않습니다. 현재 DGMC는 SARS-CoV-2를 테스트하기 위해 두 FDA 긴급 사용 승인 시스템을 상호 교환적으로 사용합니다.

인간 지원자를 사용하여 SARS-COV-2의 양성 및 음성 비인두 및 타액 표본을 확보하는 테스트 검증 연구입니다. Eppendorf Thermal Cycler PCR 시스템을 사용하여 표본으로서 타액의 테스트 성능을 표준 비인두 표본과 비교합니다.

이 프로토콜은 DGMC 환자의 두 가지 편의 샘플을 활용합니다. 환자(즉, 입원 환자, 외래 환자) 지난 72시간 동안 COVID-19 검사에서 양성 판정을 받은 사람, DGMC에서 COVID-19 검사를 받기 위해 출석했지만 음성 결과가 나온 사람. 두 그룹의 환자 모두 72시간 이내에 COVID-19 테스트를 위한 타액 샘플을 제공할 의향이 있습니다. 모집단은 DGMC 환자인 현역, DoD 부양 가족 및 퇴직자로 구성됩니다. 이 연구는 최소 60명의 개인을 등록할 것입니다. NP 결과가 음성인 참가자 30명과 NP 결과가 양성인 참가자 30명의 타액 샘플만 처리됩니다. 이 연구는 NP 테스트에서 COVID-19 양성인 참가자 30명의 타액과 NP 결과 쌍을 얻은 후 양성 환자 모집을 중단합니다. 이 연구는 NP 테스트에서 COVID-19 음성인 30명의 참가자로부터 타액과 NP 결과 쌍을 얻은 후 음성 환자를 적극적으로 모집하는 것을 중단합니다. 30명의 양성 환자를 포획하기 위해 30명 이상의 음성 환자를 모집할 수 있습니다.

잠재적인 연구 참가자를 식별하고 COVID-19 테스트를 위해 출석하는 COVID-19에 노출되거나 관련 증상이 있는 환자를 대상으로 HIPAA 면제를 활용하여 양성 환자 모집 노력이 수행됩니다. HIPAA 면제는 지난 72시간 이내에 양성 COVID-19 NP 테스트를 받은 환자(입원 환자, 외래 환자)를 식별하는 데 사용됩니다. 이 환자들과 DGMC에서 COVID-19 검사를 받을 다른 사람들에게 연구에 대한 정보를 제공할 것입니다.

참여에 관심이 있는 환자는 연구 직원에게 연락할 것입니다. 참여 자격이 있는 사람에게는 연구 문서(동의서 및 HIPAA 승인 양식)가 제공되며, 나중에 환자와 연구 직원이 이를 검토하고 서명합니다. 그 후, 추가 정보(연락처, 인구통계) 및 자가 수집 타액 표본을 얻습니다.

COVID-19 양성 또는 감염 가능성이 있는 환자와의 접촉을 최소화하기 위해 문서에 서명하고 자체 수집한 타액 샘플을 채취할 때 직원은 스크럽(또는 실험실 가운), 장갑, 보안경 및 N95 마스크를 착용합니다. 서명이 필요한 문서는 마스크를 착용하고 연구 직원 또는 차량에서 최소 6피트의 거리를 유지하면서 환자가 서명합니다. 동의 및 HIPAA 승인 양식에 서명합니다. 서명된 원본 문서는 연구 직원이 보관하고 사본은 참가자에게 제공됩니다. 두 문서에 서명한 후 연구 직원은 인구 통계(연령, 민족, 인종 및 성별) 및 연락처 정보(향후 연락이 필요한 경우 이름, 이메일 주소), 생년월일 및 자체 수집한 타액 샘플을 얻습니다.

타액 샘플을 수집하기 전에 연구 직원은 참가자가 이전 10분 동안 담배를 피우거나 먹거나 마시지 않았는지 확인합니다. 참가자에게는 생물학적 위험 가방, 라벨(6자리 숫자 코드 포함), 내부에 운송 매체가 없는 25ml 플라스틱 표본 튜브가 제공됩니다. 그런 다음 약 2mL의 타액으로 채우도록 요청했습니다. 충분한 샘플이 수집되었는지 확인하기 위해 튜브에 표시가 있을 것입니다. 참가자는 뚜껑을 닫고 튜브 외부에 라벨을 붙인 다음 라벨이 붙은 튜브를 생물학적 위험 봉투에 넣도록 지시받습니다. 그런 다음 참가자는 DGMC 또는 연구 팀 구성원이 보유한 두 번째 생물학적 위험 가방에 가방에 넣은 표본을 넣습니다. 이중 백에 든 자체 수집 타액 샘플은 얼음 팩이 들어 있는 연구 냉각기에 넣습니다. 그런 다음 타액 표본은 일괄 처리되어 CIF로 이송됩니다.

NP 테스트를 통해 COVID-19 음성인 참가자 30명의 타액과 NP 쌍을 얻은 후 NP 양성 참가자로부터 채취한 샘플에 대해서만 타액 테스트를 수행합니다. COVID-19 양성 환자를 포착하려는 시도에 등록된 COVID-19 상태를 알 수 없는 환자는 타액 검사를 수행하기 전에 NP 결과를 검색하기 위해 의료 기록에 액세스할 수 있습니다. NP 결과가 양성이면 타액 검사가 수행됩니다.

테스트는 역전사 중합효소 연쇄 반응(RTPCR)을 사용하여 타액 샘플에서 수행됩니다. 천연 및/또는 합성 RNA를 획득하여 양성 대조군으로 사용합니다. RT-PCR은 SARS-CoV-2의 E-유전자와 N-유전자를 대상으로 합니다.

1. 샘플 수집 후 5분 이내에 샘플은 안정화를 위해 차갑게 보관됩니다. 참가자가 샘플을 제공하는 위치로 내부에 얼음 팩이 있는 쿨러를 가져갑니다. 샘플은 생물학적 위험 백에 넣은 다음 일괄적으로 CIF 실험실로 운반하기 위해 즉시 냉각기에 넣습니다.
2. 리보핵산(RNA) 추출 - 12시간 이내에 Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA Mini Kit(Life Technologies)를 사용하여 검체에서 RNA를 추출합니다. 샘플 RNA는 사용할 때까지 -80oC에서 보관됩니다.
3. Eppendorf Mastercyler Pro S(Eppendorf)를 사용하여 검체에 존재하는 바이러스 RNA의 검출 및 증폭을 위해 PlatinumTM Taq(Life Technologies)가 포함된 SuperScriptTM III One-Step RT-PCR이 사용됩니다. CDC 및 기타 간행물을 기반으로 한 최대 7개의 프라이머 쌍이 사용됩니다.18-19 엔벨로프 단백질 유전자에서 3개, 뉴클레오캡시드 단백질 유전자에서 4개.
4. 냉동 샘플을 테스트하고 배치로 실행합니다.
5. PCR 제품은 Mini-Protein® Tetra Cell(Bio-Rad)을 사용하여 겔 전기영동으로 평가됩니다.
6. 시퀀싱 - 허용 가능한 앰플리콘을 생성하는 모든 PCR 반응은 ABI 3130(Life Technologies)을 사용하여 가능한 시퀀싱 확인을 위해 -80oC에 보관됩니다.

테스트가 완료되면 표본을 나누어 -80oC에서 보관합니다.

타액 샘플은 음성, 양성 또는 결정적이지 않은 것으로 해석됩니다. 대상에서 감지가 없으면 음성으로 보고됩니다. 1개의 표적이 감지되면 결정적이지 않습니다. 2개 이상의 대상이 감지되면 양성입니다.

연구 직원은 각 SARS-CoV-2 양성 NP 결과와 관련된 실험실 접근 번호에 액세스하여 DGMC 임상 실험실에서 테스트 수행에 사용된 기기의 원시 데이터 인쇄를 요청합니다. 이 정보는 두 테스트 방법 간의 불일치를 평가하는 데 사용됩니다.