Vlastní odběr vzorků slin bez virového transportního média pro testování COVID-19 prostřednictvím RT-PCR

Toto je popisná studie, která se pokusí ověřit postup detekce SARS-CoV-2 na systému Eppendorf Thermal Cycler PCR s použitím samosbíraných slin jako vzorku. Vyšetřovatelé vypočítají procentuální shodu a 95% intervaly spolehlivosti (tj. celkovou shodu, procentuální pozitivní shodu a procentuální negativní shodu) mezi vzorky slin, které si sami odebrali (vyhodnoceno na systému Eppendorf Thermal Cycler PCR) a vzorky z nosohltanu odebranými zdravotnickým pracovníkem. (vyhodnoceno buď na systému BioFire® FilmArray® Torch® nebo Cepheid® GeneXpert® jako zlatý standard). Účastníci bez použitelných výsledků pro slinnou i nazofaryngeální metodu nebudou do analýz zařazeni. V současné době DGMC používá oba systémy schvalování nouzového použití FDA k testování SARS-CoV-2.

S využitím lidských dobrovolníků k získání pozitivních a negativních vzorků z nosohltanu a slin SARS-COV-2 se jedná o studii validaci testu. Využívá systém Eppendorf Thermal Cycler PCR k porovnání účinnosti testu slin jako vzorku se standardním nazofaryngeálním vzorkem.

Tento protokol využívá dva různé vzorky pacientů s DGMC. Pacienti (tj. hospitalizovaní, ambulantní pacienti) s pozitivním testem na COVID-19 za posledních 72 hodin a ti, kteří se dostaví k testování na COVID-19 na DGMC a mají negativní výsledky. Obě skupiny pacientů jsou ochotny poskytnout vzorek slin pro testování na COVID-19 do 72 hodin. Populace se bude skládat z aktivní služby, závislých na ministerstvu obrany a důchodců, kteří jsou pacienty DGMC. Do této studie se zapíše minimálně 60 jedinců. Budou zpracovány pouze vzorky slin od 30 účastníků s negativními a 30 s pozitivními výsledky NP. Studie zastaví nábor pozitivních pacientů po získání párových výsledků slin a NP od 30 účastníků, kteří jsou pozitivní na COVID-19 podle NP testu. Studie zastaví aktivní nábor negativních pacientů po získání párových výsledků slin a NP od 30 účastníků, kteří jsou na COVID-19 negativní pomocí NP testu. Ve snaze zachytit 30 pozitivních pacientů může být přijato více než 30 negativních pacientů.

Nábor pozitivních pacientů bude prováděn s využitím výjimky HIPAA k identifikaci potenciálních účastníků studie a také zaměřením na pacienty vystavené COVID-19 a/nebo s příznaky souvisejícími s COVID-19, kteří se dostaví k testování na COVID-19. Výjimka HIPAA bude použita k identifikaci pacientů (lůžkových, ambulantních), kteří měli pozitivní test COVID-19 NP během posledních 72 hodin. Tito pacienti, stejně jako další, kteří budou testováni na COVID-19 v DGMC, budou o studii informováni.

Pacienti se zájmem o účast kontaktují pracovníky studie. Osoby způsobilé k účasti obdrží studijní dokumenty (souhlas a autorizační formulář HIPAA), které budou později zkontrolovány a podepsány pacientem a personálem studie. Poté budou získány další informace (kontaktní, demografické) a vzorek slin, který jste sami odebrali.

Aby se minimalizoval kontakt s pacienty pozitivními na COVID-19 nebo potenciálně infikovanými pacienty při podepisování dokumentů a získávání vzorku slin, který si sami odebrali, budou zaměstnanci nosit peeling (nebo laboratorní plášť), rukavice, ochranu očí a masku N95. Dokumenty vyžadující podpis podepíše pacient s maskou a dodržuje vzdálenost nejméně 6 stop od studijního personálu nebo od jeho vozidla. Souhlas a autorizační formuláře HIPAA budou podepsány. Originály podepsaných dokumentů si ponechají studijní pracovníci a jejich kopie bude poskytnuta účastníkovi. Po podepsání obou dokumentů pracovníci studie získají demografické (věk, etnická příslušnost, rasa a pohlaví) a kontaktní informace (jméno, e-mailovou adresu, pokud si přejete budoucí kontakt), datum narození a vzorek slin, který jste sami odebrali.

Před odběrem vzorku slin se pracovníci studie ujistí, že účastník během předchozích 10 minut nic nekouřil, nejedl ani nepil. Účastníci obdrží biohazardový sáček, štítek (s 6místným číselným kódem), 25ml plastovou zkumavku na vzorky bez transportního média uvnitř. Poté byl požádán, aby ji naplnil přibližně 2 ml slin. Na zkumavce bude označení, které zajistí, že bude odebrán dostatečný vzorek. Účastník bude instruován, aby zavřel víko, umístil štítek na vnější stranu zkumavky a poté vložil označenou zkumavku do vaku pro biologické nebezpečí. Účastníci poté umístí zabalené vzorky do druhého vaku pro biologické nebezpečí, který drží buď DGMC nebo člen studijního týmu. Vzorek slin ve dvou sáčcích se pak umístí do chladicího boxu obsahujícího balíček ledu. Vzorky slin pak budou transportovány do CIF v dávce.

Po získání párových výsledků slin a NP od 30 účastníků, kteří jsou negativní na COVID-19 pomocí NP testu, bude testování slin provedeno pouze na vzorcích odebraných od NP pozitivních účastníků. Pacienti s neznámým stavem COVID-19, kteří se zaregistrovali do pokusu zachytit pacienta pozitivního na COVID-19, budou mít přístup k lékařskému záznamu, aby bylo možné získat výsledek NP před provedením testování slin. Pokud je výsledek NP pozitivní, provede se vyšetření slin.

Testování bude provedeno na vzorcích slin pomocí reverzní transkripční polymerázové řetězové reakce (RTPCR). Přírodní a/nebo syntetická RNA bude získána pro použití jako pozitivní kontrola. RT-PCR se zaměří na E-gen a N-gen SARS-CoV-2.

1. Do 5 minut po odběru vzorku bude vzorek udržován v chladu pro stabilizaci. Chladič s ledem uvnitř bude odvezen na místo, kde účastník poskytne vzorek. Vzorek bude vložen do sáčku pro biologické nebezpečí, poté bude okamžitě umístěn do chladiče pro transport do laboratoře CIF v dávce.
2. Extrakce ribonukleové kyseliny (RNA) – Do 12 hodin bude RNA extrahována ze vzorků pomocí Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA Mini Kit (Life Technologies). Vzorek RNA bude až do použití skladován při -80oC.
3. SuperScriptTM III One-Step RT-PCR s PlatinumTM Taq (Life Technologies) bude použita pro detekci a amplifikaci virové RNA přítomné ve vzorcích pomocí Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf). Bude použito až sedm párů primerů, které vycházejí z CDC a dalších publikací.18-19 Tři z genu pro obalový protein a čtyři z genu pro nukleokapsidový protein.
4. Zmrazené vzorky budou testovány a zpracovávány v dávkách.
5. Produkty PCR budou hodnoceny gelovou elektroforézou s použitím Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad).
6. Sekvenování - Všechny PCR reakce, které produkují přijatelné amplikony, budou uloženy při -80oC pro případné potvrzení sekvenování pomocí ABI 3130 (Life Technologies).

Po dokončení testování budou vzorky rozděleny na alikvoty a skladovány při -80oC.

Vzorky slin budou interpretovány jako negativní, pozitivní nebo neprůkazné. Negativní bude hlášeno, když v žádném cíli není detekce; neprůkazné, když je detekován 1 cíl; a pozitivní, když jsou detekovány 2 nebo více cílů.

Zaměstnanci studie získají přístup k přístupovému číslu laboratoře spojenému s každým pozitivním výsledkem NP na SARS-CoV-2, aby si vyžádali vytištění nezpracovaných dat z přístroje použitého k provádění testování z klinické laboratoře DGMC. Tyto informace budou použity k vyhodnocení případných nesrovnalostí mezi těmito dvěma zkušebními metodami.