Самостоятельно собранные образцы слюны без вирусной транспортной среды для тестирования на COVID-19 с помощью ОТ-ПЦР

Это описательное исследование, целью которого является проверка процедуры обнаружения SARS-CoV-2 в системе ПЦР Eppendorf Thermal Cycler с использованием самостоятельно собранной слюны в качестве образца. Исследователи рассчитывают процент совпадения и 95% доверительные интервалы (т. е. общее совпадение, процент положительного совпадения и процент отрицательного совпадения) между образцами слюны, взятыми самостоятельно (оцененными на системе ПЦР Eppendorf Thermal Cycler) и образцами из носоглотки, собранными медицинским работником. (оценивается либо на системе BioFire® FilmArray® Torch®, либо на Cepheid® GeneXpert® в качестве золотого стандарта). Участники без пригодных для использования результатов как по слюне, так и по носоглотке не будут включены в анализ. В настоящее время DGMC взаимозаменяемо использует обе системы разрешения FDA на экстренное использование для тестирования на SARS-CoV-2.

Это проверочное исследование с использованием добровольцев для получения положительных и отрицательных образцов носоглотки и слюны на SARS-COV-2. Он использует систему ПЦР Eppendorf Thermal Cycler для сравнения характеристик слюны в качестве образца со стандартным образцом из носоглотки.

В этом протоколе используются две разные удобные выборки пациентов DGMC. Пациенты (т. стационарные, амбулаторные) с положительным тестом на COVID-19 за последние 72 часа, а также те, кто поступил на тестирование на COVID-19 в DGMC и имеет отрицательный результат. Обе группы пациентов готовы предоставить образец слюны для тестирования на COVID-19 в течение 72 часов. Население будет состоять из действующих лиц, иждивенцев Министерства обороны США и пенсионеров, являющихся пациентами DGMC. В этом исследовании примут участие не менее 60 человек. Будут обработаны только образцы слюны от 30 участников с отрицательными и 30 с положительными результатами NP. Исследование прекратит набор положительных пациентов после получения парных результатов слюны и NP от 30 участников, у которых COVID-19 положительный по тесту NP. Исследование прекратит активный набор отрицательных пациентов после получения парных результатов слюны и NP от 30 участников, у которых тест NP дал отрицательный результат на COVID-19. Более 30 отрицательных пациентов могут быть завербованы в попытке захватить 30 положительных пациентов.

Усилия по набору положительных пациентов будут проводиться с использованием отказа от требований HIPAA для выявления потенциальных участников исследования, а также для пациентов, подвергшихся воздействию COVID-19 и/или имеющих симптомы, связанные с COVID-19, которые представляются для тестирования на COVID-19. HIPAA Waiver будет использоваться для выявления пациентов (стационарных, амбулаторных), у которых в течение последних 72 часов был положительный тест на COVID-19 NP. Эти пациенты, а также другие пациенты, которые будут проходить тестирование на COVID-19 в DGMC, будут проинформированы об исследовании.

Пациенты, заинтересованные в участии, свяжутся с персоналом исследования. Тем, кто имеет право на участие, будут предоставлены документы об исследовании (согласие и форма авторизации HIPAA), которые позже будут рассмотрены и подписаны пациентом и исследовательским персоналом. После этого будет получена дополнительная информация (контактная, демографическая) и образец слюны, взятый самостоятельно.

Чтобы свести к минимуму контакт с пациентами с положительным или потенциально инфицированным COVID-19 при подписании документов и получении образца слюны, собранного самостоятельно, персонал будет носить медицинские халаты (или лабораторный халат), перчатки, защитные очки и маску N95. Документы, требующие подписи, должны быть подписаны пациентом в маске и на расстоянии не менее 6 футов от исследовательского персонала или их автомобиля. Формы согласия и авторизации HIPAA будут подписаны. Оригиналы подписанных документов будут храниться у исследовательского персонала, а копия будет предоставлена ​​участнику. После того, как оба документа будут подписаны, исследовательский персонал получит демографические данные (возраст, этническая принадлежность, раса и пол) и контактную информацию (имя, адрес электронной почты, если желателен контакт в будущем), дату рождения и образец слюны, взятый самостоятельно.

Перед сбором образца слюны исследовательский персонал должен убедиться, что участник ничего не курил, не ел и не пил в течение предыдущих 10 минут. Участникам будет выдан пакет для биологической защиты, этикетка (с 6-значным числовым кодом), пластиковая пробирка для образцов объемом 25 мл без транспортной среды внутри. Затем попросили наполнить его примерно 2 мл слюны. На пробирке будет маркировка, чтобы убедиться, что собрано достаточное количество пробы. Участнику будет предложено закрыть крышку, поместить этикетку на внешнюю сторону пробирки, а затем положить пробирку с маркировкой в ​​пакет для биологической опасности. Затем участники помещают образец в мешке во второй мешок для биологической опасности, который находится либо в DGMC, либо в члене исследовательской группы. Затем самостоятельно собранный образец слюны в двойном пакете будет помещен в холодильник для исследования, содержащий пакет со льдом. Затем образцы слюны будут доставлены на CIF партиями.

После получения парных результатов слюны и NP от 30 участников с отрицательным результатом теста NP на COVID-19 тестирование слюны будет проводиться только на образцах, взятых у участников с положительным результатом на NP. Пациенты с неизвестным статусом COVID-19, зарегистрированные в попытке зафиксировать пациента с положительным результатом на COVID-19, получат доступ к медицинской карте для получения результата NP перед выполнением анализа слюны. Если результат NP будет положительным, будет проведен анализ слюны.

Тестирование будет проводиться на образцах слюны с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RTPCR). Природная и/или синтетическая РНК будет получена для использования в качестве положительного контроля. ОТ-ПЦР будет нацелена на E-ген и N-ген SARS-CoV-2.

1. В течение 5 минут после взятия образца образец будет храниться холодным для стабилизации. Кулер с пакетом со льдом внутри будет доставлен в место, где участник предоставит образец. Образец будет помещен в пакет для биологической защиты, а затем немедленно помещен в холодильник для транспортировки в лабораторию CIF партиями.
2. Экстракция рибонуклеиновой кислоты (РНК) — в течение 12 часов РНК будет экстрагирована из образцов с использованием мини-набора Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA (Life Technologies). Образец РНК будет храниться при температуре -80°C до использования.
3. Одноэтапная ОТ-ПЦР SuperScriptTM III с PlatinumTM Taq (Life Technologies) будет использоваться для обнаружения и амплификации вирусной РНК, присутствующей в образцах, с использованием Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf). Будет использовано до семи пар праймеров, основанных на CDC и других публикациях.18-19 Три из гена белка оболочки и четыре из гена белка нуклеокапсида.
4. Замороженные образцы будут тестироваться и запускаться партиями.
5. Продукты ПЦР будут оцениваться с помощью гель-электрофореза с использованием Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad).
6. Секвенирование. Все реакции ПЦР, в результате которых образуются приемлемые ампликоны, будут храниться при температуре -80°C для возможного подтверждения секвенирования с использованием ABI 3130 (Life Technologies).

После завершения тестирования образцы разделяют на аликвоты и хранят при температуре -80°C.

Образцы слюны будут интерпретироваться как отрицательные, положительные или неубедительные. Отрицательный будет сообщен, когда ни одна цель не будет обнаружена; безрезультатно при обнаружении 1 цели; и положительный при обнаружении 2 и более целей.

Исследовательский персонал получит доступ к регистрационному номеру лаборатории, связанному с каждым положительным результатом NP на SARS-CoV-2, чтобы запросить в клинической лаборатории DGMC распечатку необработанных данных с прибора, используемого для проведения тестирования. Эта информация будет использоваться для оценки любых расхождений между двумя методами тестирования.