RT-PCR による COVID-19 テスト用のウイルス輸送媒体を使用しない自己収集唾液サンプル

これは、自己採取した唾液を検体として使用して、エッペンドルフ サーマル サイクラー PCR システムで SARS-CoV-2 を検出する手順を検証しようとする記述的研究です。 治験責任医師は、自己採取した唾液サンプル (Eppendorf Thermal Cycler PCR システムで評価) と医療従事者が採取した鼻咽頭サンプルとの間の一致率と 95% 信頼区間 (つまり、全体的な一致、肯定的な一致率、および否定的な一致率) を計算します。 (BioFire® FilmArray® Torch® システムまたはゴールド スタンダードとしての Cepheid® GeneXpert® で評価)。 唾液と鼻咽頭の両方の方法で使用可能な結果のない参加者は、分析に含まれません。 現在、DGMC は両方の FDA 緊急使用許可システムを交換可能に使用して、SARS-CoV-2 の検査を行っています。

人間のボランティアを使用して、SARS-COV-2 の陽性および陰性の鼻咽頭および唾液検体を取得する、これは試験検証研究です。 Eppendorf Thermal Cycler PCR システムを使用して、検体としての唾液の試験性能を標準的な鼻咽頭検体と比較します。

このプロトコルは、DGMC 患者の 2 つの異なる便利なサンプルを利用します。 患者（つまり 入院患者、外来患者) 過去 72 時間以内に COVID-19 検査が陽性であった患者、および DGMC で COVID-19 検査を受け、結果が陰性であった患者。 どちらのグループの患者も、COVID-19 検査用の唾液サンプルを 72 時間以内に提供する意思があります。 人口は、現役、国防総省の扶養家族、および DGMC 患者である退職者で構成されます。 この研究には、少なくとも 60 人が登録されます。 陰性の 30 人の参加者と陽性の NP 結果の 30 人の唾液サンプルのみが処理されます。 この研究は、NPテストによってCOVID-19陽性である30人の参加者からペアの唾液とNPの結果を得た後、陽性患者の募集を停止します。 この研究では、NPテストによってCOVID-19陰性である30人の参加者から唾液とNPのペアの結果を得た後、陰性患者の積極的な募集を停止します。 30 人の陽性患者を捕捉するために、30 人を超える陰性患者を募集する場合があります。

陽性患者の採用活動は、HIPAA免除を利用して潜在的な研究参加者を特定するとともに、COVID-19検査に出席するCOVID-19にさらされた、および/またはCOVID-19に関連する症状のある患者を対象に実施されます。 HIPAA Waiver は、過去 72 時間以内に COVID-19 NP 検査で陽性となった患者 (入院患者、外来患者) を特定するために使用されます。 これらの患者、および DGMC で COVID-19 検査を受ける他の患者には、この研究について通知されます。

参加に関心のある患者は、研究スタッフと連絡を取ります。 参加資格のある者には、研究文書 (同意書および HIPAA 承認フォーム) が渡され、後で患者と研究スタッフによってレビューおよび署名されます。 その後、追加情報 (連絡先、人口統計)、および自己収集唾液標本が取得されます。

COVID-19 陽性または感染の可能性のある患者との接触を最小限に抑えるため、スタッフはスクラブ (または白衣)、手袋、目の保護具、N95 マスクを着用します。 署名が必要な文書は、マスクを着用し、研究スタッフまたは車両から少なくとも 6 フィートの距離を保ちながら、患者によって署名されます。 同意書と HIPAA 承認書に署名します。 署名されたオリジナルの文書は研究スタッフによって保管され、コピーが参加者に提供されます。 両方の文書に署名した後、研究スタッフは、人口統計 (年齢、民族、人種、性別) と連絡先情報 (名前、将来連絡が必要な場合は電子メール アドレス)、生年月日、および自己採取した唾液サンプルを取得します。

唾液サンプルを採取する前に、研究スタッフは参加者が過去 10 分間喫煙、飲食をしていないことを確認します。 参加者には、バイオハザード バッグ、ラベル (6 桁の数字コード付き)、輸送媒体が入っていない 25 ml のプラスチック製試験管が渡されます。 その後、約 2 mL の唾液で満たすように求められます。 十分なサンプルが収集されるように、チューブにマーキングがあります。 参加者は、蓋を閉め、ラベルをチューブの外側に置き、ラベルの付いたチューブをバイオハザード バッグに入れるように指示されます。 参加者は、袋に入れられた標本を、DGMC または研究チームのメンバーが保持する 2 番目のバイオハザード バッグの中に入れます。 二重袋に入れられた自己収集唾液サンプルは、アイスパックを含む研究用クーラーに入れられます。 唾液標本は、バッチで CIF に転送されます。

NP テストによって COVID-19 陰性の 30 人の参加者からペアの唾液と NP の結果を得た後、唾液検査は NP 陽性の参加者から収集されたサンプルに対してのみ実行されます。 COVID-19 陽性患者を捕まえるために登録された COVID-19 状態が不明な患者は、唾液検査を実施する前に NP 結果を取得するために医療記録にアクセスします。 NPの結果が陽性の場合、唾液検査が行われます。

テストは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RTPCR）を使用して唾液サンプルで実行されます。 ポジティブコントロールとして使用するために、天然および/または合成RNAが取得されます。 RT-PCR は、SARS-CoV-2 の E 遺伝子と N 遺伝子をターゲットにします。

1. サンプル収集の 5 分以内に、サンプルは安定化のために低温に保たれます。 参加者がサンプルを提供する場所には、アイスパックが入ったクーラーが運ばれます。 サンプルはバイオハザードバッグに入れられ、すぐにクーラーに入れられ、バッチで CIF 研究所に輸送されます。
2. リボ核酸 (RNA) 抽出 - 12 時間以内に、Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA Mini Kit (Life Technologies) を使用して RNA を標本から抽出します。 サンプル RNA は、使用するまで -80oC で保存されます。
3. Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｌｅｒ Ｐｒｏ Ｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いた試料中に存在するウイルスＲＮＡの検出および増幅には、ＰｌａｔｉｎｕｍＴＭ Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩワンステップＲＴ－ＰＣＲを使用する。 CDC および他の刊行物に基づく最大 7 つのプライマー ペアが使用されます。 エンベロープタンパク質遺伝子から3つ、ヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子から4つ。
4. 凍結サンプルは、バッチでテストおよび実行されます。
5. PCR 産物は、Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad) を使用したゲル電気泳動で評価されます。
6. シーケンシング - 許容可能なアンプリコンを生成するすべての PCR 反応は、ABI 3130 (Life Technologies) を使用して可能なシーケンシング確認のために -80oC で保存されます。

試験が完了したら、検体を分注し、-80oC で保存します。

唾液サンプルは、陰性、陽性、または決定的でないと解釈されます。 どのターゲットでも検出されない場合、陰性が報告されます。 1 つのターゲットが検出された場合は決定的ではありません。 2 つ以上のターゲットが検出された場合は陽性です。

研究スタッフは、SARS-CoV-2 陽性 NP の各結果に関連付けられているラボ アクセッション番号にアクセスして、DGMC 臨床ラボから、テストの実行に使用された機器からの生データの印刷を要求します。 この情報は、2 つのテスト方法の不一致を評価するために使用されます。