Samodzielnie pobrane próbki śliny bez nośników transportujących wirusy do testów na obecność COVID-19 metodą RT-PCR

Jest to badanie opisowe, które ma na celu sprawdzenie poprawności procedury wykrywania SARS-CoV-2 w systemie Eppendorf Thermal Cycler PCR przy użyciu samodzielnie pobranej śliny jako próbki. Badacze obliczą procentową zgodność i 95% przedziały ufności (tj. ogólną zgodność, procentową zgodność pozytywną i procentową zgodność negatywną) między pobranymi przez siebie próbkami śliny (ocenianymi w systemie Eppendorf Thermal Cycler PCR) a próbkami nosogardzieli pobranymi przez pracownika służby zdrowia (ocenione w systemie BioFire® FilmArray® Torch® lub Cepheid® GeneXpert® jako złoty standard). Uczestnicy bez użytecznych wyników zarówno dla metody ślinowej, jak i nosowo-gardłowej nie zostaną uwzględnieni w analizach. Obecnie DGMC używa zamiennie obu systemów autoryzacji użycia awaryjnego FDA do testowania SARS-CoV-2.

Wykorzystanie ludzkich ochotników do uzyskania dodatnich i ujemnych próbek SARS-COV-2 z jamy nosowo-gardłowej i śliny jest to badanie walidacyjne. Korzysta z systemu Eppendorf Thermal Cycler PCR, aby porównać skuteczność testu śliny jako próbki ze standardową próbką nosowo-gardłową.

Protokół ten wykorzystuje dwie różne dogodne próbki pacjentów DGMC. Pacjenci (tj. pacjenci hospitalizowani, pacjenci ambulatoryjni) z pozytywnym wynikiem testu na obecność COVID-19 w ciągu ostatnich 72 godzin oraz ci, którzy zgłaszają się na test na obecność COVID-19 w DGMC i mają wynik ujemny. Obie grupy pacjentów są chętne do oddania próbki śliny do badania na obecność COVID-19 w ciągu 72 godzin. Populacje będą składać się z czynnej służby, osób pozostających na utrzymaniu DoD i emerytów, którzy są pacjentami DGMC. Badanie to obejmie co najmniej 60 osób. Przetwarzane będą tylko próbki śliny od 30 uczestników z wynikiem ujemnym i od 30 z wynikiem pozytywnym NP. Badanie zakończy rekrutację pacjentów z wynikiem pozytywnym po uzyskaniu sparowanych wyników śliny i NP od 30 uczestników, którzy mają pozytywny wynik testu na obecność COVID-19 w teście NP. Badanie zakończy aktywną rekrutację pacjentów z wynikiem ujemnym po uzyskaniu sparowanych wyników śliny i NP od 30 uczestników, u których wynik testu NP na obecność COVID-19 był ujemny. Można zrekrutować ponad 30 negatywnych pacjentów, próbując uchwycić 30 pozytywnych pacjentów.

Rekrutacja pacjentów z pozytywnym wynikiem będzie prowadzona z wykorzystaniem zwolnienia HIPAA w celu zidentyfikowania potencjalnych uczestników badania, a także ukierunkowana na pacjentów narażonych na COVID-19 i/lub z objawami związanymi z COVID-19, którzy zgłaszają się na testy w kierunku COVID-19. Zwolnienie HIPAA będzie wykorzystywane do identyfikacji pacjentów (szpitalnych, ambulatoryjnych), u których w ciągu ostatnich 72 godzin uzyskano pozytywny wynik testu COVID-19 NP. Ci pacjenci, a także inni, którzy będą mieli wykonywane testy na obecność COVID-19 w DGMC, zostaną poinformowani o badaniu.

Pacjenci zainteresowani udziałem skontaktują się z personelem badania. Osoby uprawnione do udziału otrzymają dokumenty badania (zgodę i formularz autoryzacji HIPAA), które zostaną później przejrzane i podpisane przez pacjenta i personel badania. Następnie zostaną uzyskane dodatkowe informacje (kontaktowe, demograficzne) oraz samodzielnie pobrana próbka śliny.

Aby zminimalizować kontakt z pacjentami z pozytywnym wynikiem lub potencjalnie zakażonymi COVID-19 podczas podpisywania dokumentów i pobierania samodzielnie pobranej próbki śliny, personel będzie nosił fartuch (lub fartuch laboratoryjny), rękawiczki, ochronę oczu i maskę N95. Dokumenty wymagające podpisu będą podpisywane przez pacjenta w masce i w odległości co najmniej 6 stóp od personelu badawczego lub pojazdu. Zgoda i formularze autoryzacji HIPAA zostaną podpisane. Oryginalne, podpisane dokumenty będą przechowywane przez pracowników badania, a kopia zostanie dostarczona uczestnikowi. Po podpisaniu obu dokumentów personel badawczy uzyska dane demograficzne (wiek, pochodzenie etniczne, rasę i płeć) oraz dane kontaktowe (imię i nazwisko, adres e-mail, jeśli potrzebny jest kontakt w przyszłości), datę urodzenia oraz samodzielnie pobraną próbkę śliny.

Przed pobraniem próbki śliny personel badawczy upewni się, że uczestnik nie palił, nie jadł ani nie pił niczego przez ostatnie 10 minut. Uczestnicy otrzymają worek na zagrożenie biologiczne, etykietę (z 6-cyfrowym kodem numerycznym), plastikową probówkę o pojemności 25 ml bez środka transportowego w środku. Następnie poprosił o wypełnienie go około 2 ml śliny. Na probówce będzie oznaczenie, które zapewni pobranie wystarczającej próbki. Uczestnik zostanie poinstruowany, aby zamknąć wieczko, umieścić etykietę na zewnątrz tuby, a następnie włożyć oznaczoną tubę do worka z zagrożeniem biologicznym. Następnie uczestnicy umieszczają zapakowaną próbkę w drugiej torbie na zagrożenie biologiczne, znajdującej się w posiadaniu DGMC lub członka zespołu badawczego. Próbka śliny pobrana w podwójnych torebkach zostanie następnie umieszczona w chłodziarce badawczej zawierającej okład z lodu. Próbki śliny będą następnie transportowane partiami do CIF.

Po uzyskaniu sparowanych wyników śliny i NP od 30 uczestników z ujemnym wynikiem testu na obecność COVID-19 w teście NP, badanie śliny zostanie przeprowadzone tylko na próbkach pobranych od uczestników NP-dodatnich. Pacjenci z nieznanym statusem COVID-19, zarejestrowani w celu schwytania pacjenta z dodatnim wynikiem COVID-19, będą mieli dostęp do dokumentacji medycznej w celu pobrania wyniku NP przed wykonaniem badania śliny. Jeśli wynik NP jest pozytywny, zostanie przeprowadzone badanie śliny.

Testy zostaną przeprowadzone na próbkach śliny przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RTPCR). Naturalne i/lub syntetyczne RNA zostanie pozyskane do wykorzystania jako kontrola pozytywna. RT-PCR będzie ukierunkowany na geny E i geny N SARS-CoV-2.

1. W ciągu 5 minut od pobrania próbki próbka będzie schłodzona w celu ustabilizowania. Lodówka z lodem w środku zostanie zabrana do miejsca, w którym uczestnik dostarczy próbkę. Próbka zostanie umieszczona w worku na wypadek zagrożenia biologicznego, a następnie natychmiast umieszczona w lodówce w celu transportu do laboratorium CIF partiami.
2. Ekstrakcja kwasu rybonukleinowego (RNA) — w ciągu 12 godzin z próbek zostanie wyekstrahowany RNA przy użyciu minizestawu Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA (Life Technologies). Próbka RNA będzie przechowywana w temperaturze -80oC do momentu użycia.
3. SuperScriptTM III One-Step RT-PCR with PlatinumTM Taq (Life Technologies) zostanie użyty do wykrywania i amplifikacji wirusowego RNA obecnego w próbkach przy użyciu Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf). Wykorzystanych zostanie do siedmiu par starterów opartych na CDC i innych publikacjach.18-19 Trzy z genu białka otoczki i cztery z genu białka nukleokapsydu.
4. Zamrożone próbki będą testowane i uruchamiane partiami.
5. Produkty PCR będą oceniane za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu komórki Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad).
6. Sekwencjonowanie — wszystkie reakcje PCR, w wyniku których powstają akceptowalne amplikony, będą przechowywane w temperaturze -80oC w celu ewentualnego potwierdzenia sekwencjonowania przy użyciu ABI 3130 (Life Technologies).

Po zakończeniu badania próbki zostaną podzielone na porcje i przechowywane w temperaturze -80oC.

Próbki śliny będą interpretowane jako negatywne, pozytywne lub niejednoznaczne. Negatywny zostanie zgłoszony, gdy nie zostanie wykryty żaden cel; niejednoznaczne, gdy wykryty zostanie 1 cel; i dodatnie, gdy wykryto 2 lub więcej celów.

Personel badania uzyska dostęp do numeru dostępu do laboratorium powiązanego z każdym dodatnim wynikiem NP SARS-CoV-2, aby poprosić o wydruk z laboratorium klinicznego DGMC nieprzetworzonych danych z instrumentu użytego do wykonania testu. Informacje te zostaną wykorzystane do oceny wszelkich rozbieżności między dwiema metodami testowania.