自采集的不含病毒传输介质的唾液样本，用于通过 RT-PCR 进行 COVID-19 检测

这是一项描述性研究，将尝试验证在 Eppendorf 热循环仪 PCR 系统上使用自收集的唾液作为样本检测 SARS-CoV-2 的程序。 研究人员将计算自行收集的唾液样本（在 Eppendorf Thermal Cycler PCR 系统上评估）与医护人员收集的鼻咽样本之间的一致性百分比和 95% 置信区间（即总体一致性、阳性一致性百分比和阴性一致性百分比） （在作为黄金标准的 BioFire® FilmArray® Torch® 系统或 Cepheid® GeneXpert® 上进行评估）。 没有唾液和鼻咽方法可用结果的参与者将不包括在分析中。 目前，DGMC 交替使用两种 FDA 紧急使用授权系统来测试 SARS-CoV-2。

使用人类志愿者获取 SARS-COV-2 的阳性和阴性鼻咽和唾液标本，这是一项测试验证研究。 它使用 Eppendorf Thermal Cycler PCR 系统将唾液作为标本与标准鼻咽标本的测试性能进行比较。

该协议使用 DGMC 患者的两种不同的便利样本。 患者（即 住院患者、门诊患者）在过去 72 小时内 COVID-19 检测结果呈阳性，以及在 DGMC 接受 COVID-19 检测结果呈阴性的患者。 两组患者都愿意在 72 小时内提供唾液样本进行 COVID-19 检测。 这些人群将由现役军人、国防部家属和身为 DGMC 患者的退休人员组成。 这项研究将招募至少 60 人。 仅处理来自 30 名阴性和 30 名 NP 结果阳性参与者的唾液样本。 在获得 30 名通过 NP 测试呈 COVID-19 阳性的参与者的配对唾液和 NP 结果后，该研究将停止招募阳性患者。 在获得 30 名通过 NP 测试为 COVID-19 阴性的参与者的配对唾液和 NP 结果后，该研究将停止积极招募阴性患者。 可能会招募超过 30 名阴性患者以试图捕获 30 名阳性患者。

阳性患者的招募工作将利用 HIPAA 豁免进行，以确定潜在的研究参与者，以及针对暴露于 COVID-19 和/或具有 COVID-19 相关症状并参加 COVID-19 检测的患者。 HIPAA 豁免将用于识别在过去 72 小时内 COVID-19 NP 测试呈阳性的患者（住院患者、门诊患者）。 这些患者以及将在 DGMC 进行 COVID-19 检测的其他患者将被告知该研究。

有兴趣参与的患者将与研究人员联系。 那些有资格参加的人将获得研究文件（同意书和 HIPAA 授权表），稍后将由患者和研究人员审查和签署。 此后，将获得其他信息（联系方式、人口统计）和自行收集的唾液样本。

在签署文件和获取自行收集的唾液样本时，为尽量减少与 COVID-19 阳性或潜在感染患者的接触，工作人员将穿戴防护服（或实验室外套）、手套、护目镜和 N95 口罩。 需要签名的文件将由患者在佩戴口罩并与研究人员或其车辆保持至少 6 英尺的距离时签署。 将签署同意书和 HIPAA 授权书。 原始的、签名的文件将由研究人员保存，并将向参与者提供一份副本。 两份文件签署后，研究人员将获得人口统计信息（年龄、民族、种族和性别）和联系信息（姓名、电子邮件地址，如果需要日后联系）、出生日期和自行收集的唾液样本。

在收集唾液样本之前，研究人员将确保参与者在之前的 10 分钟内没有吸烟、进食或喝任何东西。 参与者将获得一个生物危害袋、标签（带有 6 位数字代码）、25 毫升塑料试管，里面没有运输介质。 然后要求用大约 2 mL 的唾液填充它。 试管上会有一个标记，以确保收集到足够的样本。 参与者将被指示关闭盖子，将标签放在管子的外面，然后将贴有标签的管子放入生物危害袋中。 然后，参与者将把袋装标本放入 DGMC 或研究小组成员持有的第二个生物危害袋中。 然后将双层袋子自行收集的唾液样本放入装有冰袋的研究冷却器中。 唾液标本会分批运往CIF。

在从 30 名通过 NP 测试呈 COVID-19 阴性的参与者中获得成对的唾液和 NP 结果后，将仅对从 NP 阳性参与者收集的样本进行唾液测试。 COVID-19 状态未知的患者，为了捕获 COVID-19 阳性患者而登记，将在进行唾液检测之前访问医疗记录以检索 NP 结果。 如果 NP 结果为阳性，将进行唾液测试。

将使用逆转录聚合酶链反应 (RTPCR) 对唾液样本进行测试。 将获得天然和/或合成的 RNA 用作阳性对照。 RT-PCR 将针对 SARS-CoV-2 的 E 基因和 N 基因。

1. 在样品采集后 5 分钟内，样品将保持低温以稳定。 内部装有冰袋的冷却器将被带到参与者提供样品的位置。 样品将被放入生物危害袋中，然后立即放入冷却器中，以分批运送至CIF实验室。
2. 核糖核酸 (RNA) 提取 - 在 12 小时内，使用 Invitrogen PureLink ® 病毒 RNA/DNA 小型试剂盒（Life Technologies）从标本中提取 RNA。 样品 RNA 将储存在 -80oC 直至使用。
3. SuperScriptTM III One-Step RT-PCR with PlatinumTM Taq (Life Technologies) 将用于使用 Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf) 检测和扩增标本中存在的病毒 RNA。 最多将使用来自 CDC 和其他出版物的七对引物。 18-19 三个来自包膜蛋白基因，四个来自核衣壳蛋白基因。
4. 冷冻样品将进行分批检测和运行。
5. 将使用 Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad) 通过凝胶电泳评估 PCR 产物。
6. 测序——所有产生可接受扩增子的 PCR 反应都将储存在 -80oC 下，以便使用 ABI 3130 (Life Technologies) 进行可能的测序确认。

测试完成后，样本将被分装并储存在 -80oC 下。

唾液样本将被解释为阴性、阳性或不确定。 任何目标均未检测到则报阴性；当检测到 1 个目标时不确定；当检测到 2 个或更多目标时为阳性。

研究人员将访问与每个 SARS-CoV-2 阳性 NP 结果相关的实验室登录号，以请求 DGMC 临床实验室打印用于执行测试的仪器的原始数据。 此信息将用于评估两种测试方法之间的任何差异。