Muestras de saliva auto-recolectadas sin medios de transporte viral para pruebas de COVID-19 a través de RT-PCR

Este es un estudio descriptivo que intentará validar el procedimiento para detectar SARS-CoV-2 en el sistema de PCR Eppendorf Thermal Cycler utilizando saliva recolectada como muestra. Los investigadores calcularán el porcentaje de concordancia y los intervalos de confianza del 95 % (es decir, concordancia general, concordancia porcentual positiva y concordancia negativa porcentual) entre las muestras de saliva recolectadas por ellos mismos (evaluadas en el sistema PCR Eppendorf Thermal Cycler) y las muestras nasofaríngeas recolectadas por el trabajador de la salud. (evaluado en el sistema BioFire® FilmArray® Torch® o Cepheid® GeneXpert® como estándar de oro). Los participantes sin resultados utilizables para los métodos de saliva y nasofaríngeo no se incluirán en los análisis. Actualmente, la DGMC utiliza indistintamente ambos sistemas de autorización de uso de emergencia de la FDA para evaluar el SARS-CoV-2.

Utilizando voluntarios humanos para obtener muestras nasofaríngeas y de saliva positivas y negativas de SARS-COV-2, este es un estudio de validación de prueba. Utiliza el sistema PCR Eppendorf Thermal Cycler para comparar el rendimiento de la prueba de saliva como muestra con la muestra nasofaríngea estándar.

Este protocolo utiliza dos muestras de conveniencia diferentes de pacientes de DGMC. pacientes (es decir, pacientes hospitalizados, ambulatorios) con una prueba COVID-19 positiva en las últimas 72 horas, y aquellos que se presenten para la prueba COVID-19 en DGMC y tengan resultados negativos. Ambos grupos de pacientes están dispuestos a proporcionar una muestra de saliva para la prueba de COVID-19 dentro de las 72 horas. Las poblaciones estarán compuestas por servicio activo, dependientes del Departamento de Defensa y jubilados que son pacientes de DGMC. Este estudio inscribirá al menos a 60 personas. Solo se procesarán muestras de saliva de 30 participantes con resultados negativos y 30 con resultados positivos de NP. El estudio dejará de reclutar pacientes positivos después de obtener los resultados emparejados de saliva y NP de 30 participantes que dieron positivo en COVID-19 mediante la prueba NP. El estudio dejará de reclutar activamente pacientes negativos después de obtener los resultados emparejados de saliva y NP de 30 participantes que dieron negativo en COVID-19 mediante la prueba NP. Se pueden reclutar más de 30 pacientes negativos en un intento de capturar 30 pacientes positivos.

Los esfuerzos de reclutamiento para pacientes positivos se llevarán a cabo utilizando una exención de HIPAA para identificar a los posibles participantes del estudio, así como a los pacientes expuestos y/o con síntomas relacionados con COVID-19 que se presenten para la prueba de COVID-19. La exención HIPAA se utilizará para identificar a los pacientes (pacientes hospitalizados, ambulatorios) que hayan tenido una prueba NP de COVID-19 positiva en las últimas 72 horas. Estos pacientes, así como otros que se someterán a la prueba de COVID-19 en la DGMC, serán informados del estudio.

Los pacientes interesados ​​en participar se pondrán en contacto con el personal del estudio. Aquellos elegibles para participar recibirán documentos del estudio (formulario de autorización de HIPAA y consentimiento), que luego serán revisados ​​y firmados por el paciente y el personal del estudio. A partir de entonces, se obtendrá información adicional (contacto, datos demográficos) y una muestra de saliva auto-recolectada.

Para minimizar el contacto con pacientes con COVID-19 positivo o potencialmente infectados al firmar documentos y obtener la muestra de saliva recolectada por ellos mismos, el personal usará una bata (o una bata de laboratorio), guantes, protección para los ojos y una máscara N95. Los documentos que requieran firma serán firmados por el paciente mientras usa una máscara y mantiene una distancia de al menos 6 pies del personal del estudio o de su vehículo. Se firmarán formularios de consentimiento y autorización de HIPAA. El personal del estudio conservará los documentos originales firmados y se proporcionará una copia al participante. Después de que se hayan firmado ambos documentos, el personal del estudio obtendrá información demográfica (edad, etnia, raza y sexo) y de contacto (nombre, dirección de correo electrónico si se desea un contacto futuro), fecha de nacimiento y la muestra de saliva recolectada por él mismo.

Antes de recolectar la muestra de saliva, el personal del estudio se asegurará de que el participante no haya fumado, comido ni bebido nada durante los 10 minutos anteriores. Los participantes recibirán una bolsa de riesgo biológico, una etiqueta (con un código numérico de 6 dígitos), un tubo de muestra de plástico de 25 ml sin medio de transporte en el interior. Luego se le pidió que lo llenara con aproximadamente 2 mL de saliva. Habrá una marca en el tubo para asegurar que se recolecta una muestra suficiente. Se le indicará al participante que cierre la tapa, coloque la etiqueta en el exterior del tubo y luego coloque el tubo etiquetado en la bolsa de riesgo biológico. Luego, los participantes colocarán la muestra en bolsa dentro de una segunda bolsa de riesgo biológico en poder de la DGMC o de un miembro del equipo de estudio. Luego, la muestra de saliva recolectada en una bolsa doble se colocará en la hielera del estudio que contiene una bolsa de hielo. Luego, las muestras de saliva se transportarán al CIF en lotes.

Después de obtener los resultados emparejados de saliva y NP de 30 participantes que dieron negativo en COVID-19 mediante la prueba NP, la prueba de saliva solo se realizará en muestras recolectadas de participantes NP positivos. A los pacientes con estado desconocido de COVID-19, inscritos en un intento de capturar a un paciente positivo de COVID-19, se accederá al registro médico para recuperar el resultado de NP antes de realizar la prueba de saliva. Si el resultado de la NP es positivo, se realizará una prueba de saliva.

Las pruebas se realizarán en muestras de saliva utilizando la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RTPCR). Se adquirirá ARN natural y/o sintético para su uso como control positivo. RT-PCR apuntará al gen E y al gen N del SARS-CoV-2.

1. Dentro de los 5 minutos posteriores a la recolección de la muestra, la muestra se mantendrá fría para su estabilización. Se llevará una hielera con una bolsa de hielo en el interior al lugar donde el participante entrega la muestra. La muestra se colocará en una bolsa de riesgo biológico, luego se colocará inmediatamente en el enfriador para su transporte al Laboratorio CIF en lotes.
2. Extracción de ácido ribonucleico (ARN): en un plazo de 12 horas, se extraerá el ARN de las muestras con el minikit de ARN/ADN viral PureLink ® de Invitrogen (Life Technologies). La muestra de ARN se almacenará a -80oC hasta su uso.
3. Se utilizará SuperScriptTM III One-Step RT-PCR con PlatinumTM Taq (Life Technologies) para la detección y amplificación del ARN viral presente en muestras utilizando Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf). Se utilizarán hasta siete pares de cebadores basados ​​en los CDC y otras publicaciones.18-19 Tres del gen de la proteína de la envoltura y cuatro del gen de la proteína de la nucleocápside.
4. Las muestras congeladas se analizarán y procesarán en lotes.
5. Los productos de la PCR se evaluarán con electroforesis en gel utilizando Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad).
6. Secuenciación: todas las reacciones de PCR que produzcan amplicones aceptables se almacenarán a -80 °C para una posible confirmación de la secuenciación mediante ABI 3130 (Life Technologies).

Una vez finalizadas las pruebas, las muestras se dividirán en alícuotas y se almacenarán a -80 °C.

Las muestras de saliva se interpretarán como negativas, positivas o no concluyentes. Se informará negativo cuando no haya detección en ningún objetivo; no concluyente cuando se detecta 1 objetivo; y positivo cuando se detectan 2 o más objetivos.

El personal del estudio accederá al número de acceso del laboratorio asociado con cada resultado positivo de NP de SARS-CoV-2 para solicitar una copia impresa, del laboratorio clínico de la DGMC, de los datos sin procesar del instrumento utilizado para realizar las pruebas. Esta información se utilizará para evaluar cualquier discrepancia entre los dos métodos de prueba.