Zelf verzamelde speekselmonsters zonder virale transportmedia voor COVID-19-testen via RT-PCR

Dit is een beschrijvende studie die zal proberen de procedure voor het detecteren van SARS-CoV-2 op het Eppendorf Thermal Cycler PCR-systeem te valideren met behulp van zelf verzameld speeksel als monster. Onderzoekers zullen het percentage overeenstemming en de 95% betrouwbaarheidsintervallen (d.w.z. algehele overeenstemming, percentage positieve overeenstemming en percentage negatieve overeenstemming) berekenen tussen zelf afgenomen speekselmonsters (beoordeeld op het Eppendorf Thermal Cycler PCR-systeem) en door zorgverleners verzamelde nasofaryngeale monsters. (geëvalueerd op het BioFire® FilmArray® Torch®-systeem of de Cepheid® GeneXpert® als de gouden standaard). Deelnemers zonder bruikbare resultaten voor zowel de speeksel- als de nasofaryngeale methode worden niet meegenomen in de analyses. Momenteel gebruikt DGMC beide FDA Emergency Use Authorization-systemen door elkaar om te testen op SARS-CoV-2.

Dit is een testvalideringsonderzoek waarbij menselijke vrijwilligers worden gebruikt om positieve en negatieve nasofaryngeale en speekselspecimens van SARS-COV-2 te verkrijgen. Het maakt gebruik van het Eppendorf Thermal Cycler PCR-systeem om de testprestaties van speeksel als monster te vergelijken met het standaard nasofaryngeale monster.

Dit protocol maakt gebruik van twee verschillende gemaksmonsters van DGMC-patiënten. Patiënten (d.w.z. intramuraal, poliklinisch) met een positieve COVID-19-test in de afgelopen 72 uur, en degenen die zich aanmelden voor COVID-19-testen bij DGMC en een negatieve uitslag hebben. Beide groepen patiënten zijn bereid om binnen 72 uur een speekselmonster af te staan ​​voor COVID-19-testen. De populaties zullen bestaan ​​uit actieve dienst, DoD-afhankelijken en gepensioneerden die DGMC-patiënten zijn. Deze studie zal ten minste 60 personen inschrijven. Alleen speekselmonsters van 30 deelnemers met een negatieve en 30 met een positieve NP-uitslag worden in behandeling genomen. De studie stopt met het werven van positieve patiënten na het verkrijgen van de gepaarde speeksel- en NP-resultaten van 30 deelnemers die COVID-19-positief zijn door NP-test. De studie zal stoppen met het actief rekruteren van negatieve patiënten na het verkrijgen van de gepaarde speeksel- en NP-resultaten van 30 deelnemers die COVID-19-negatief zijn door NP-test. Er kunnen meer dan 30 negatieve patiënten worden geworven in een poging om 30 positieve patiënten vast te leggen.

Wervingsinspanningen voor positieve patiënten zullen worden uitgevoerd met behulp van een HIPAA-vrijstelling om potentiële studiedeelnemers te identificeren, en gericht op patiënten die zijn blootgesteld aan en/of symptomen hebben die verband houden met COVID-19 en die zich presenteren voor COVID-19-testen. De HIPAA Waiver zal worden gebruikt om patiënten (intramuraal, ambulant) te identificeren die in de afgelopen 72 uur een positieve COVID-19 NP-test hebben gehad. Deze patiënten, evenals anderen die COVID-19-testen zullen ondergaan bij DGMC, zullen op de hoogte worden gebracht van het onderzoek.

Patiënten die geïnteresseerd zijn in deelname zullen contact opnemen met het studiepersoneel. Degenen die in aanmerking komen voor deelname, krijgen onderzoeksdocumenten (toestemming en HIPAA-autorisatieformulier), die later worden beoordeeld en ondertekend door de patiënt en het onderzoekspersoneel. Daarna wordt aanvullende informatie (contact, demografie) en een zelf verzameld speekselmonster verkregen.

Om contact met COVID-19-positieve of mogelijk geïnfecteerde patiënten te minimaliseren bij het ondertekenen van documenten en het verkrijgen van het zelf afgenomen speekselmonster, draagt ​​het personeel scrubs (of een laboratoriumjas), handschoenen, oogbescherming en een N95-masker. Documenten die moeten worden ondertekend, worden door de patiënt ondertekend terwijl hij een masker draagt ​​en een afstand van ten minste 1,8 meter behoudt van het onderzoekspersoneel of van hun voertuig. Toestemming en HIPAA-autorisatieformulieren worden ondertekend. De originele, ondertekende documenten worden bewaard door het studiepersoneel en een kopie wordt verstrekt aan de deelnemer. Nadat beide documenten zijn ondertekend, krijgt het onderzoekspersoneel demografische (leeftijd, etniciteit, ras en geslacht) en contactgegevens (naam, e-mailadres als toekomstig contact gewenst is), geboortedatum en het zelf verzamelde speekselmonster.

Voorafgaand aan het verzamelen van het speekselmonster, zal het onderzoekspersoneel ervoor zorgen dat de deelnemer de afgelopen 10 minuten niets heeft gerookt, gegeten of gedronken. Deelnemers krijgen een zak voor biologisch gevaarlijk materiaal, een etiket (met een 6-cijferige code), een plastic monsterbuisje van 25 ml zonder transportmedium erin. Vervolgens gevraagd om het te vullen met ongeveer 2 ml speeksel. Er zal een markering op de buis zijn om ervoor te zorgen dat er voldoende monster wordt verzameld. De deelnemer krijgt de instructie om het deksel te sluiten, het etiket op de buitenkant van de buis te plaatsen en vervolgens de gelabelde buis in de zak voor biologisch gevaarlijk materiaal te doen. De deelnemers zullen dan het verpakte monster in een tweede zak voor biologisch gevaarlijk materiaal plaatsen die wordt vastgehouden door DGMC of een lid van het onderzoeksteam. Het zelfverzamelde speekselmonster in dubbele zak wordt vervolgens in de studiekoeler met een ijszak geplaatst. Speekselspecimens worden vervolgens in batch naar de CIF getransporteerd.

Na het verkrijgen van de gepaarde speeksel- en NP-resultaten van 30 deelnemers die COVID-19-negatief zijn door NP-test, worden speekseltesten alleen uitgevoerd op monsters die zijn verzameld van NP-positieve deelnemers. Patiënten met een onbekende COVID-19-status, ingeschreven in een poging een COVID-19-positieve patiënt vast te leggen, krijgen toegang tot het medisch dossier om het NP-resultaat op te halen voordat speekseltesten worden uitgevoerd. Als de NP-uitslag positief is, wordt er een speekseltest uitgevoerd.

Er zullen tests worden uitgevoerd op speekselmonsters met behulp van reverse-transcription polymerase chain reaction (RTPCR). Natuurlijk en/of synthetisch RNA wordt verkregen voor gebruik als positieve controle. RT-PCR zal zich richten op het E-gen en het N-gen van SARS-CoV-2.

1. Binnen 5 minuten na monstername wordt het monster koud gehouden voor stabilisatie. Een koelbox met daarin een ijszak wordt meegenomen naar de locatie waar de deelnemer het monster aanlevert. Het monster wordt in een zak voor biologisch gevaarlijk materiaal gedaan en vervolgens onmiddellijk in de koeler geplaatst voor transport naar het CIF-laboratorium in batches.
2. Ribonucleïnezuur (RNA)-extractie - Binnen 12 uur wordt RNA uit de monsters geëxtraheerd met behulp van Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA Mini Kit (Life Technologies). Monster-RNA wordt tot gebruik bij -80oC bewaard.
3. SuperScriptTM III One-Step RT-PCR met PlatinumTM Taq (Life Technologies) zal worden gebruikt voor detectie en amplificatie van viraal RNA aanwezig in monsters met Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf). Er zullen maximaal zeven primerparen worden gebruikt die zijn gebaseerd op CDC en andere publicaties.18-19 Drie van het envelop-eiwitgen en vier van het nucleocapside-eiwitgen.
4. Bevroren monsters worden getest en in batches uitgevoerd.
5. PCR-producten zullen worden geëvalueerd met gelelektroforese met behulp van de Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad).
6. Sequentiebepaling - Alle PCR-reacties die acceptabele amplicons produceren, worden opgeslagen bij -80oC voor mogelijke bevestiging van de sequentie met behulp van de ABI 3130 (Life Technologies).

Zodra het testen is voltooid, worden monsters verdeeld en bewaard bij -80oC.

Speekselmonsters worden geïnterpreteerd als negatief, positief of onduidelijk. Negatief wordt gerapporteerd wanneer er geen detectie is in een doel; onduidelijk wanneer 1 doelwit wordt gedetecteerd; en positief wanneer 2 of meer doelen worden gedetecteerd.

Het onderzoekspersoneel heeft toegang tot het laboratoriumtoegangsnummer dat is gekoppeld aan elk SARS-CoV-2-positief NP-resultaat om een ​​afdruk aan te vragen bij het DGMC-klinisch laboratorium van de onbewerkte gegevens van het instrument dat wordt gebruikt om tests uit te voeren. Deze informatie zal worden gebruikt om eventuele discrepanties tussen de twee testmethoden te evalueren.