Campioni di saliva raccolti autonomamente senza terreno di trasporto virale per test COVID-19 tramite RT-PCR

Questo è uno studio descrittivo che tenterà di convalidare la procedura per il rilevamento di SARS-CoV-2 sul sistema Eppendorf Thermal Cycler PCR utilizzando la saliva auto-raccolta come campione. Gli investigatori calcoleranno la concordanza percentuale e gli intervalli di confidenza del 95% (vale a dire concordanza complessiva, concordanza percentuale positiva e concordanza percentuale negativa) tra i campioni di saliva raccolti autonomamente (valutati con il sistema Eppendorf Thermal Cycler PCR) e i campioni nasofaringei raccolti dagli operatori sanitari (valutato sul sistema BioFire® FilmArray® Torch® o su Cepheid® GeneXpert® come gold standard). I partecipanti senza risultati utilizzabili per entrambi i metodi salivari e rinofaringei non saranno inclusi nelle analisi. Attualmente, DGMC utilizza entrambi i sistemi di autorizzazione all'uso di emergenza della FDA in modo intercambiabile per testare SARS-CoV-2.

Utilizzando volontari umani per ottenere campioni rinofaringei e saliva positivi e negativi di SARS-COV-2, questo è uno studio di convalida del test. Utilizza il sistema PCR Eppendorf Thermal Cycler per confrontare le prestazioni del test della saliva come campione con il campione nasofaringeo standard.

Questo protocollo utilizza due diversi campioni di convenienza dei pazienti DGMC. I pazienti (es. ricoverati, ambulatoriali) con test COVID-19 positivo nelle ultime 72 ore, e coloro che si presentano per il test COVID-19 alla DGMC e hanno esito negativo. Entrambi i gruppi di pazienti sono disposti a fornire un campione di saliva per il test COVID-19 entro 72 ore. Le popolazioni saranno composte da personale in servizio attivo, dipendenti dal Dipartimento della Difesa e pensionati che sono pazienti DGMC. Questo studio arruolerà almeno 60 persone. Verranno elaborati solo i campioni di saliva di 30 partecipanti con risultati NP negativi e 30 con risultati NP positivi. Lo studio interromperà il reclutamento di pazienti positivi dopo aver ottenuto i risultati accoppiati di saliva e NP da 30 partecipanti positivi al COVID-19 mediante test NP. Lo studio smetterà di reclutare attivamente pazienti negativi dopo aver ottenuto i risultati accoppiati di saliva e NP da 30 partecipanti che sono negativi al COVID-19 al test NP. Più di 30 pazienti negativi possono essere reclutati nel tentativo di catturare 30 pazienti positivi.

Gli sforzi di reclutamento per i pazienti positivi saranno condotti utilizzando un'esenzione HIPAA per identificare i potenziali partecipanti allo studio, nonché mirare ai pazienti esposti a e/o con sintomi correlati a COVID-19 che si presentano per il test COVID-19. La rinuncia HIPAA verrà utilizzata per identificare i pazienti (ricoverati, ambulatoriali) che hanno avuto un test NP COVID-19 positivo nelle ultime 72 ore. Questi pazienti, così come altri che saranno sottoposti a test COVID-19 presso DGMC, saranno informati dello studio.

I pazienti interessati alla partecipazione prenderanno contatto con il personale dello studio. Gli idonei a partecipare riceveranno i documenti dello studio (consenso e modulo di autorizzazione HIPAA), che saranno successivamente esaminati e firmati dal paziente e dal personale dello studio. Successivamente, verranno ottenute ulteriori informazioni (contatto, dati demografici) e un campione di saliva auto-raccolto.

Per ridurre al minimo il contatto con pazienti positivi o potenzialmente infetti da COVID-19 durante la firma dei documenti e l'ottenimento del campione di saliva auto-prelevato, il personale indosserà camici (o camice da laboratorio), guanti, protezione per gli occhi e maschera N95. I documenti che richiedono la firma saranno firmati dal paziente indossando una maschera e mantenendo una distanza di almeno 6 piedi dal personale dello studio o dal proprio veicolo. Saranno firmati i moduli di consenso e di autorizzazione HIPAA. I documenti originali e firmati saranno conservati dal personale dello studio e una copia sarà fornita al partecipante. Dopo che entrambi i documenti sono stati firmati, il personale dello studio otterrà le informazioni demografiche (età, etnia, razza e sesso) e di contatto (nome, indirizzo e-mail se si desidera un contatto futuro), la data di nascita e il campione di saliva auto-prelevato.

Prima di raccogliere il campione di saliva, il personale dello studio si assicurerà che il partecipante non abbia fumato, mangiato o bevuto nulla negli ultimi 10 minuti. I partecipanti riceveranno un sacchetto di rischio biologico, un'etichetta (con un codice numerico a 6 cifre), una provetta di plastica da 25 ml senza mezzo di trasporto all'interno. Quindi ha chiesto di riempirlo con circa 2 ml di saliva. Ci sarà una marcatura sulla provetta per garantire che venga raccolto un campione sufficiente. Il partecipante verrà incaricato di chiudere il coperchio, posizionare l'etichetta all'esterno del tubo, quindi inserire il tubo etichettato nella borsa a rischio biologico. I partecipanti posizioneranno quindi il campione insaccato all'interno di un secondo sacchetto a rischio biologico tenuto da DGMC o da un membro del gruppo di studio. Il campione di saliva auto-raccolto in doppio sacchetto verrà quindi inserito nel dispositivo di raffreddamento dello studio contenente un impacco di ghiaccio. I campioni di saliva verranno quindi trasportati al CIF in lotti.

Dopo aver ottenuto i risultati accoppiati di saliva e NP da 30 partecipanti negativi al COVID-19 mediante test NP, il test della saliva verrà eseguito solo su campioni raccolti da partecipanti positivi a NP. I pazienti con stato COVID-19 sconosciuto, arruolati nel tentativo di catturare un paziente positivo al COVID-19, avranno accesso alla cartella clinica per recuperare il risultato NP prima di eseguire il test della saliva. Se il risultato NP è positivo, verrà eseguito il test della saliva.

I test saranno eseguiti su campioni di saliva utilizzando la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RTPCR). Verrà acquisito RNA naturale e/o sintetico da utilizzare come controllo positivo. RT-PCR mirerà al gene E e al gene N di SARS-CoV-2.

1. Entro 5 minuti dalla raccolta del campione, il campione verrà mantenuto freddo per la stabilizzazione. Un dispositivo di raffreddamento con un impacco di ghiaccio all'interno verrà portato nel luogo in cui il partecipante fornisce il campione. Il campione verrà inserito in un sacchetto a rischio biologico, quindi immediatamente collocato nel dispositivo di raffreddamento per il trasporto al laboratorio CIF in batch.
2. Estrazione dell'acido ribonucleico (RNA) - Entro 12 ore, l'RNA verrà estratto dai campioni utilizzando il mini kit Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA (Life Technologies). L'RNA del campione verrà conservato a -80oC fino al momento dell'utilizzo.
3. SuperScriptTM III One-Step RT-PCR con PlatinumTM Taq (Life Technologies) verrà utilizzato per il rilevamento e l'amplificazione dell'RNA virale presente nei campioni utilizzando Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf). Verranno utilizzate fino a sette coppie di primer basate su CDC e altre pubblicazioni.18-19 Tre dal gene della proteina dell'involucro e quattro dal gene della proteina del nucleocapside.
4. I campioni congelati saranno testati e analizzati in lotti.
5. I prodotti di PCR saranno valutati con elettroforesi su gel utilizzando la Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad).
6. Sequenziamento - Tutte le reazioni PCR che producono ampliconi accettabili saranno conservate a -80oC per una possibile conferma del sequenziamento utilizzando l'ABI 3130 (Life Technologies).

Una volta completati i test, i campioni verranno aliquotati e conservati a -80oC.

I campioni di saliva saranno interpretati come negativi, positivi o non conclusivi. Negativo verrà segnalato quando non vi è alcun rilevamento in alcun target; inconcludente quando viene rilevato 1 target; e positivo quando vengono rilevati 2 o più bersagli.

Il personale dello studio accederà al numero di accesso al laboratorio associato a ciascun risultato NP positivo SARS-CoV-2 per richiedere una stampa, dal laboratorio clinico DGMC, dei dati grezzi dallo strumento utilizzato per eseguire il test. Queste informazioni saranno utilizzate per valutare eventuali discrepanze tra i due metodi di test.