Selbst gesammelte Speichelproben ohne Virustransportmedien für COVID-19-Tests über RT-PCR

Dies ist eine beschreibende Studie, die versucht, das Verfahren zum Nachweis von SARS-CoV-2 auf dem Eppendorf Thermal Cycler PCR-System unter Verwendung von selbst gesammeltem Speichel als Probe zu validieren. Die Prüfärzte berechnen die prozentuale Übereinstimmung und die 95 %-Konfidenzintervalle (d. h. Gesamtübereinstimmung, prozentuale positive Übereinstimmung und prozentuale negative Übereinstimmung) zwischen selbst entnommenen Speichelproben (ausgewertet auf dem Eppendorf Thermal Cycler PCR-System) und von medizinischem Personal entnommenen Nasen-Rachen-Proben (evaluiert entweder auf dem BioFire® FilmArray® Torch® System oder dem Cepheid® GeneXpert® als Goldstandard). Teilnehmer ohne verwertbare Ergebnisse sowohl für die Speichel- als auch für die Nasen-Rachen-Methode werden nicht in die Analysen aufgenommen. Derzeit verwendet DGMC beide FDA-Notfallgenehmigungssysteme abwechselnd, um auf SARS-CoV-2 zu testen.

Dies ist eine Testvalidierungsstudie, bei der menschliche Freiwillige verwendet werden, um positive und negative Nasen-Rachen- und Speichelproben von SARS-COV-2 zu erhalten. Es verwendet das Eppendorf Thermal Cycler PCR-System, um die Testleistung von Speichel als Probe mit der Standard-Nasen-Rachen-Probe zu vergleichen.

Dieses Protokoll verwendet zwei verschiedene Convenience-Proben von DGMC-Patienten. Patienten (z. stationär, ambulant) mit einem positiven COVID-19-Test in den letzten 72 Stunden und diejenigen, die sich für einen COVID-19-Test beim DGMC vorstellen und negative Ergebnisse haben. Beide Patientengruppen sind bereit, innerhalb von 72 Stunden eine Speichelprobe für COVID-19-Tests abzugeben. Die Populationen bestehen aus aktiven Diensten, Angehörigen des Verteidigungsministeriums und Rentnern, die DGMC-Patienten sind. An dieser Studie werden mindestens 60 Personen teilnehmen. Es werden nur Speichelproben von 30 Teilnehmern mit negativen und 30 mit positiven NP-Ergebnissen verarbeitet. Die Studie wird die Rekrutierung positiver Patienten einstellen, nachdem die gepaarten Speichel- und NP-Ergebnisse von 30 Teilnehmern erhalten wurden, die laut NP-Test COVID-19-positiv sind. Die Studie wird die aktive Rekrutierung negativer Patienten einstellen, nachdem die gepaarten Speichel- und NP-Ergebnisse von 30 Teilnehmern erhalten wurden, die laut NP-Test COVID-19-negativ sind. Mehr als 30 negative Patienten können rekrutiert werden, um 30 positive Patienten zu erfassen.

Rekrutierungsbemühungen für positive Patienten werden unter Verwendung einer HIPAA-Verzichtserklärung durchgeführt, um potenzielle Studienteilnehmer zu identifizieren, und zielen auf Patienten ab, die COVID-19 ausgesetzt sind und/oder Symptome im Zusammenhang mit COVID-19 haben und sich für COVID-19-Tests vorstellen. Der HIPAA-Verzicht wird verwendet, um Patienten (stationär, ambulant) zu identifizieren, die innerhalb der letzten 72 Stunden einen positiven COVID-19 NP-Test hatten. Diese Patienten sowie andere, die sich bei DGMC einem COVID-19-Test unterziehen werden, werden über die Studie informiert.

Patienten, die an einer Teilnahme interessiert sind, werden mit dem Studienpersonal Kontakt aufnehmen. Die zur Teilnahme berechtigten Personen erhalten Studiendokumente (Einwilligung und HIPAA-Autorisierungsformular), die später vom Patienten und dem Studienpersonal überprüft und unterzeichnet werden. Danach werden zusätzliche Informationen (Kontakt, Demografie) und eine selbst gesammelte Speichelprobe eingeholt.

Um den Kontakt mit COVID-19-positiven oder potenziell infizierten Patienten bei der Unterzeichnung von Dokumenten und der Entnahme der selbst entnommenen Speichelprobe zu minimieren, trägt das Personal Kittel (oder einen Laborkittel), Handschuhe, Augenschutz und eine N95-Maske. Dokumente, die eine Unterschrift erfordern, werden vom Patienten unterschrieben, während er eine Maske trägt und einen Abstand von mindestens 6 Fuß zum Studienpersonal oder zu seinem Fahrzeug einhält. Einwilligungs- und HIPAA-Autorisierungsformulare werden unterzeichnet. Die unterschriebenen Originaldokumente werden vom Studienpersonal aufbewahrt und dem Teilnehmer wird eine Kopie zur Verfügung gestellt. Nachdem beide Dokumente unterzeichnet wurden, erhält das Studienpersonal demografische (Alter, ethnische Zugehörigkeit, Rasse und Geschlecht) und Kontaktinformationen (Name, E-Mail-Adresse, falls zukünftig Kontakt gewünscht wird), das Geburtsdatum und die selbst entnommene Speichelprobe.

Vor der Entnahme der Speichelprobe stellt das Studienpersonal sicher, dass der Teilnehmer in den letzten 10 Minuten nichts geraucht, gegessen oder getrunken hat. Die Teilnehmer erhalten einen Biohazard-Beutel, ein Etikett (mit einem 6-stelligen Zahlencode), ein 25-ml-Plastikprobenröhrchen ohne Transportmedium darin. Dann gebeten, es mit ungefähr 2 ml Speichel zu füllen. Auf dem Röhrchen befindet sich eine Markierung, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Probe entnommen wird. Der Teilnehmer wird angewiesen, den Deckel zu schließen, das Etikett auf der Außenseite des Röhrchens anzubringen und dann das etikettierte Röhrchen in den Biogefährdungsbeutel zu legen. Die Teilnehmer legen dann die eingetütete Probe in einen zweiten Biogefährdungsbeutel, der entweder von der DGMC oder einem Mitglied des Studienteams gehalten wird. Die doppelt verpackte, selbst entnommene Speichelprobe wird dann in die Studienkühlbox mit Eisbeutel gegeben. Speichelproben werden dann schubweise zum CIF transportiert.

Nach Erhalt der gepaarten Speichel- und NP-Ergebnisse von 30 Teilnehmern, die laut NP-Test COVID-19-negativ sind, werden Speicheltests nur an Proben durchgeführt, die von NP-positiven Teilnehmern entnommen wurden. Bei Patienten mit unbekanntem COVID-19-Status, die in den Versuch aufgenommen wurden, einen COVID-19-positiven Patienten zu erfassen, wird auf die Krankenakte zugegriffen, um das NP-Ergebnis vor der Durchführung von Speicheltests abzurufen. Wenn das NP-Ergebnis positiv ist, wird ein Speicheltest durchgeführt.

Die Tests werden an Speichelproben mittels reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RTPCR) durchgeführt. Zur Verwendung als positive Kontrolle wird natürliche und/oder synthetische RNA erworben. RT-PCR wird auf das E-Gen und das N-Gen von SARS-CoV-2 abzielen.

1. Innerhalb von 5 Minuten nach der Probenentnahme wird die Probe zur Stabilisierung kalt gehalten. Eine Kühlbox mit einem darin befindlichen Eisbeutel wird zu dem Ort gebracht, an dem der Teilnehmer die Probe abgibt. Die Probe wird in einen Biogefährdungsbeutel gelegt und dann sofort in den Kühler gelegt, um sie chargenweise zum CIF-Labor zu transportieren.
2. Ribonukleinsäure (RNA)-Extraktion – Innerhalb von 12 Stunden wird RNA aus den Proben mit dem Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA Mini Kit (Life Technologies) extrahiert. Proben-RNA wird bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
3. SuperScriptTM III One-Step RT-PCR mit PlatinumTM Taq (Life Technologies) wird zum Nachweis und zur Amplifikation viraler RNA in Proben mit dem Eppendorf Mastercyler Pro S (Eppendorf) verwendet. Es werden bis zu sieben Primerpaare verwendet, die auf CDC- und anderen Veröffentlichungen basieren.18-19 Drei vom Hüllprotein-Gen und vier vom Nucleocapsid-Protein-Gen.
4. Gefrorene Proben werden getestet und chargenweise verarbeitet.
5. PCR-Produkte werden mit Gelelektrophorese unter Verwendung der Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad) bewertet.
6. Sequenzierung – Alle PCR-Reaktionen, die akzeptable Amplikons produzieren, werden bei –80 °C für eine mögliche Sequenzierungsbestätigung mit dem ABI 3130 (Life Technologies) gelagert.

Nach Abschluss der Tests werden die Proben aliquotiert und bei -80 °C gelagert.

Speichelproben werden als negativ, positiv oder nicht schlüssig interpretiert. Negativ wird gemeldet, wenn in keinem Ziel ein Nachweis erfolgt; nicht schlüssig, wenn 1 Ziel erkannt wird; und positiv, wenn 2 oder mehr Ziele erkannt werden.

Das Studienpersonal greift auf die Laborzugangsnummer zu, die jedem SARS-CoV-2-positiven NP-Ergebnis zugeordnet ist, um vom klinischen DGMC-Labor einen Ausdruck der Rohdaten des zur Durchführung der Tests verwendeten Instruments anzufordern. Diese Informationen werden verwendet, um etwaige Diskrepanzen zwischen den beiden Testmethoden zu bewerten.