Itse kerätyt sylkinäytteet ilman viruksen kuljetusalustaa COVID-19-testaukseen RT-PCR:n kautta

Tämä on kuvaava tutkimus, joka yrittää validoida SARS-CoV-2:n havaitsemismenettelyn Eppendorf Thermal Cycler PCR -järjestelmässä käyttämällä itse kerättyä sylkeä näytteenä. Tutkijat laskevat itse kerättyjen sylkinäytteiden (arvioitu Eppendorf Thermal Cycler PCR -järjestelmällä) ja terveydenhuollon työntekijöiden keräämien nenänielun näytteiden välillä. (Arvioitu joko BioFire® FilmArray® Torch® -järjestelmässä tai Cepheid® GeneXpert®:ssä kultastandardina). Analyyseihin ei oteta mukaan osallistujia, joilla ei ole käyttökelpoisia tuloksia sekä sylki- että nenänielun menetelmistä. Tällä hetkellä DGMC käyttää molempia FDA:n hätäkäyttölupajärjestelmiä vaihtokelpoisesti SARS-CoV-2:n testaamiseen.

Tämä on testin validointitutkimus, jossa käytetään vapaaehtoisia positiivisia ja negatiivisia nenänielun ja SARS-COV-2:n sylkinäytteitä. Se käyttää Eppendorf Thermal Cycler PCR -järjestelmää vertaamaan syljen testitulosta näytteenä tavalliseen nenänielun näytteeseen.

Tämä protokolla käyttää kahta erilaista DGMC-potilaiden mukavuusnäytettä. Potilaat (esim. laitospotilaat, avopotilaat), joilla on positiivinen COVID-19-testi viimeisen 72 tunnin aikana, sekä ne, jotka saapuvat COVID-19-testaukseen DGMC:ssä ja joiden tulokset ovat negatiiviset. Molemmat potilasryhmät ovat valmiita toimittamaan sylkinäytteen COVID-19-testausta varten 72 tunnin sisällä. Väestöt koostuvat aktiivisesta työstä, DoD-huollettavista ja eläkeläisistä, jotka ovat DGMC-potilaita. Tähän tutkimukseen otetaan vähintään 60 henkilöä. Vain 30 osallistujan sylkinäytteet, joilla on negatiivinen ja 30 positiivinen NP, käsitellään. Tutkimus lopettaa positiivisten potilaiden värväyksen saatuaan sylki- ja NP-paritulokset 30 osallistujalta, jotka ovat COVID-19-positiivisia NP-testin perusteella. Tutkimus lopettaa negatiivisten potilaiden aktiivisen värväyksen saatuaan sylki- ja NP-paritulokset 30 osallistujalta, jotka ovat COVID-19-negatiivisia NP-testin perusteella. Yli 30 negatiivista potilasta voidaan värvätä, jotta 30 positiivista potilasta saadaan kiinni.

Positiivisten potilaiden rekrytointi toteutetaan käyttämällä HIPAA-vapautusta potentiaalisten tutkimukseen osallistujien tunnistamiseksi sekä potilaiden, jotka ovat altistuneet COVID-19-oireille ja/tai joilla on siihen liittyviä oireita, jotka saapuvat COVID-19-testaukseen. HIPAA Waiveria käytetään tunnistamaan potilaat (sairaalapotilaat, avohoidot), joilla on ollut positiivinen COVID-19 NP-testi viimeisen 72 tunnin aikana. Näille potilaille sekä muille, joille tehdään COVID-19-testaus DGMC:ssä, tiedotetaan tutkimuksesta.

Osallistumisesta kiinnostuneet potilaat ottavat yhteyttä tutkimushenkilökuntaan. Osallistumiskelpoisille toimitetaan tutkimusasiakirjat (suostumus ja HIPAA-valtuutuslomake), jotka potilas ja tutkimushenkilökunta myöhemmin tarkistavat ja allekirjoittavat. Sen jälkeen hankitaan lisätietoja (yhteystiedot, väestötiedot) ja itse kerätty sylkinäyte.

Minimoidakseen kontaktin COVID-19-positiivisten tai mahdollisesti infektoituneiden potilaiden kanssa allekirjoittaessaan asiakirjoja ja hankkiessaan itse kerättyä sylkinäytteen henkilökunta käyttää kuorintaaineita (tai laboratoriotakkia), käsineitä, silmäsuojaimia ja N95-naamaria. Allekirjoitusta vaativat asiakirjat allekirjoittaa potilas maskia käyttäessään ja pitäen vähintään 6 metrin etäisyyden tutkimushenkilökuntaan tai ajoneuvoonsa. Suostumus ja HIPAA-valtuutuslomakkeet allekirjoitetaan. Alkuperäiset allekirjoitetut asiakirjat säilytetään tutkimushenkilöstön toimesta ja niistä toimitetaan kopio osallistujalle. Kun molemmat asiakirjat on allekirjoitettu, tutkimushenkilöstö saa demografiset (ikä, etnisyys, rotu ja sukupuoli) ja yhteystiedot (nimi, sähköpostiosoite, jos halutaan tulevaisuudessa ottaa yhteyttä), syntymäaika ja itse kerätyn sylkinäytteen.

Ennen sylkinäytteen ottamista tutkimushenkilöstö varmistaa, että osallistuja ei ole tupakoinut, syönyt tai juonut mitään edellisten 10 minuutin aikana. Osallistujille annetaan biohazard pussi, etiketti (6-numeroisella koodilla), 25 ml muovinen näyteputki ilman kuljetusalustaa. Sitten pyydettiin täyttämään se noin 2 ml:lla sylkeä. Putkessa on merkintä, jolla varmistetaan riittävän näytteen kerääminen. Osallistujaa neuvotaan sulkemaan kansi, asettamaan etiketti putken ulkopuolelle ja laittamaan sitten merkitty putki biovaarapussiin. Osallistujat asettavat sitten pussitetun näytteen toiseen biologisen vaaran pussiin, joka on joko DGMC:n tai tutkimusryhmän jäsenen hallussa. Kaksoispussissa itse kerätty sylkinäyte laitetaan sitten tutkimusjäähdyttimeen, jossa on jääpakkaus. Sen jälkeen sylkinäytteet kuljetetaan CIF:ään erässä.

Kun sylki- ja NP-paritulokset on saatu 30 osallistujalta, jotka ovat COVID-19-negatiivisia NP-testillä, sylkitesti suoritetaan vain näytteille, jotka on kerätty NP-positiivisilta osallistujilta. Potilaiden, joilla on tuntematon COVID-19-status ja jotka on otettu mukaan yrittäessään siepata COVID-19-positiivisen potilaan, on tarkasteltava potilastietoja NP-tuloksen hakemiseksi ennen sylkitestien suorittamista. Jos NP-tulos on positiivinen, suoritetaan sylkitutkimus.

Testaus suoritetaan sylkinäytteillä käyttämällä käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktiota (RTPCR). Luonnollinen ja/tai synteettinen RNA hankitaan käytettäväksi positiivisena kontrollina. RT-PCR kohdistuu SARS-CoV-2:n E-geeniin ja N-geeniin.

1. 5 minuutin sisällä näytteen ottamisesta näyte pidetään kylmänä stabiloitumista varten. Jääkaappi, jonka sisällä on jääpakkaus, viedään paikkaan, jossa osallistuja toimittaa näytteen. Näyte laitetaan biohazard-pussiin, jonka jälkeen se asetetaan välittömästi jäähdyttimeen kuljetettavaksi erässä CIF-laboratorioon.
2. Ribonukleiinihapon (RNA) uuttaminen – RNA uutetaan näytteistä 12 tunnin kuluessa käyttämällä Invitrogen PureLink ® Viral RNA/DNA Mini Kit -sarjaa (Life Technologies). Näyte-RNA säilytetään -80 oC:ssa käyttöön asti.
3. SuperScriptTM III One-Step RT-PCR:tä PlatinumTM Taq:n (Life Technologies) kanssa käytetään näytteissä olevan virus-RNA:n havaitsemiseen ja monistamiseen käyttämällä Eppendorf Mastercyler Pro S:tä (Eppendorf). Käytetään enintään seitsemän alukeparia, jotka perustuvat CDC:hen ja muihin julkaisuihin.18-19 Kolme vaippaproteiinigeenistä ja neljä nukleokapsidiproteiinigeenistä.
4. Pakastetut näytteet testataan ja ajetaan erissä.
5. PCR-tuotteet arvioidaan geelielektroforeesilla käyttäen Mini-Protein® Tetra Cell (Bio-Rad) -laitetta.
6. Sekvensointi - Kaikki PCR-reaktiot, jotka tuottavat hyväksyttäviä amplikoneja, säilytetään -80 oC:ssa mahdollista sekvensoinnin vahvistamista varten ABI 3130:n (Life Technologies) avulla.

Kun testaus on valmis, näytteet jaetaan eriin ja säilytetään -80 oC:ssa.

Sylkinäytteet tulkitaan negatiivisiksi, positiivisiksi tai epäselviksi. Negatiivinen raportoidaan, kun missään kohteessa ei havaita; epäselvä, kun yksi kohde havaitaan; ja positiivinen, kun havaitaan 2 tai useampia kohteita.

Tutkimushenkilöstö käyttää kuhunkin SARS-CoV-2-positiiviseen NP-tulokseen liittyvää laboratorion liittymisnumeroa pyytääkseen tulostetta DGMC:n kliinisestä laboratoriosta testin suorittamiseen käytetyn laitteen raakatiedoista. Näitä tietoja käytetään näiden kahden testausmenetelmän välisten erojen arvioimiseen.