Il microbioma nasale e la sua importanza nella malattia

Ipotesi

Si suggeriscono le seguenti ipotesi nulle:

1. Il microbioma nasale nei pazienti con disfunzione olfattiva non differisce da quello degli individui sani con olfatto normale
2. Non si verificano fluttuazioni stagionali nel microbioma nasale
3. Il panorama immunologico della mucosa nasale non è correlato a specifici microbiomi
4. Né i glucocorticoidi intranasali né dupilumab e mepolizumab influenzano il microbioma nasale e i fattori immunitari locali nei pazienti con CRSwNP. Materiali e metodi Disegno: Studio caso-controllo e studio di coorte longitudinale.

Popolazioni:

1. 60 controlli sani: senso dell'olfatto normale e assenza di malattia seno-nasale, allergie alle vie aeree superiori e nessun farmaco intranasale
2. 60 pazienti non-COVID-19 con disfunzione olfattiva
3. 15 pazienti positivi al COVID-19 in fase acuta
4. 60 pazienti affetti da COVID-19 da lungo tempo con disfunzione olfattiva persistente per più di 12 settimane
5. 60 pazienti con CRS hanno iniziato lo studio con glucocorticoidi intranasali
6. 15 pazienti con CRS che hanno iniziato il trattamento biologico

Criterio di inclusione

- Maggiore di 18 anni

Criteri di esclusione

• Per i gruppi bioptici, trattamento anticoagulante attivo
• Malattie del sistema coagulante
• Antibiotici negli ultimi tre mesi
• Altri farmaci immunomodulanti negli ultimi tre mesi
• Malattia autoimmune o immunodeficienza

Reclutamento: le popolazioni 1, 5 e 6 vengono reclutate tra i pazienti sottoposti a chirurgia seno-nasale presso il dipartimento otorinolaringoiatra, ospedale regionale di Gødstrup, Danimarca. Le popolazioni 2 e 4 sono state arruolate presso il Flavour Institute, Dipartimento di Medicina Clinica, Università di Aarhus, Danimarca, e Clinica universitaria per il sapore, l'equilibrio e il sonno, Ospedale regionale di Gødstrup, Danimarca. La popolazione 3 viene reclutata nelle lunghe cliniche COVID-19 dell'ospedale universitario di Aarhus e dell'ospedale regionale di Gødstrup. Alla popolazione 1 verranno forniti membri del personale e studenti universitari.

Esami clinici, misurazioni e informazioni: per tutti i partecipanti, vengono ottenute informazioni sull'anamnesi, sull'uso di farmaci, sull'esame obiettivo dell'orecchio, del naso e della gola, inclusa l'endoscopia delle vie aeree superiori, il test di esito sino-nasale-22[9], la depressione maggiore Inventario[10,11], Mini stato mentale[12], bastoncini da fiuto[13] e screening del gusto.

Campioni di microbioma: i tamponi dalla cavità nasale e dalla faringe orale verranno raccolti per l'analisi del microbioma utilizzando il sequenziamento di prossima generazione mirato all'RNA ribosomiale 16S e 18S. La caratterizzazione del microbioma viene eseguita mediante metagenomica basata su ampliconi 16S/18S e i dati vengono analizzati da vari strumenti bioinformatici per la determinazione/visualizzazione della diversità alfa/beta e per l'analisi delle coordinate principali (PCoA).

Fattori immunitari intranasali: le biopsie nasali (3x3x3 mm) saranno caratterizzate istologicamente e analizzate utilizzando la trascrittomica spaziale sulla piattaforma Vision 10X Genomics. La secrezione nasale viene raccolta mediante sei tamponi e utilizzata per caratterizzare il profilo delle citochine. Verrà utilizzato un ampio pannello basato su Luminex che comprende 45 citochine e chemochine (Invitrogen, Cyto-kine/Chemokine/Growth Factor Convenience 45-Plex Human ProcartaPlex™ Panel 1) e i campioni verranno analizzati in duplicato. Il pannello comprende citochine note per svolgere un ruolo nella CRS e che sono prese di mira dal trattamento biologico, come IL-4, IL-13 e IL-5.

Dati sull'uso di steroidi nasali: i pazienti che inizieranno i glucocorticoidi intranasali saranno inclusi all'inizio del trattamento e il follow-up sarà dopo 24 settimane.

Statistiche: con un alfa del 5% e una potenza dell'80%, la dimensione della popolazione per ciascun gruppo dovrebbe essere di 42 partecipanti, presupponendo che la presenza di batteri differisca del 30% tra le popolazioni. Prendendo in considerazione il 20% di abbandoni, i ricercatori mirano a includere 60 pazienti nel gruppo 1-4. Gli studi che coinvolgono i gruppi 5 e 6 sono esplorativi e generatori di ipotesi e non sono stati eseguiti calcoli di potenza. Inoltre, solo pochi pazienti soddisfano i criteri per il trattamento biologico; pertanto i ricercatori intendono includere tutti i pazienti che iniziano il trattamento biologico entro 12-18 mesi.

Fattibilità: Il progetto è una collaborazione tra il richiedente; professore, consulente senior, DMSc, Therese Ovesen, Flavour Institute, Aarhus University & The Flavour Clinic, Gødstrup Regional Hospital; e consulente senior, DMSc, Kurt Fuursted, Statens Serum Institute (SSI). Il Flavour Institute riceve pazienti da tutta la Danimarca e dal 2015 quasi 3000 pazienti hanno consultato l'unità e più di 50 studi di ricerca sulla disfunzione olfattiva sono stati pubblicati dalla Flavour Clinic and Institute. Dal 2016, presso la SSI viene condotta la diagnostica clinica di routine del microbioma, la metagenomica basata su ampliconi 16S/18S, e la competenza sia clinica che bioinformatica sarà fornita in questo campo dalla SSI. Il progetto sfrutta ulteriormente la collaborazione con l’iniziativa CellX ospitata presso il MOMA, che è un’iniziativa nazionale che fornisce competenze e infrastrutture per gli omici a cellula singola. Nel complesso, i ricercatori garantiscono sia il numero di pazienti richiesto, sia una solida e vasta esperienza con tutti i metodi di test, le attrezzature e l'infrastruttura necessaria.

I requisiti normativi per gli Studi 1 e 2 sono in vigore e l’arruolamento dei pazienti e la raccolta dei campioni di microbioma sono già iniziati.

Etica: nessuno dei test dell'olfatto o del gusto, né il campionamento del microbioma e dei fattori immunitari provoca pericolo, disagio o dolore. Il GDPR è rispettato in tutti gli studi e i dati vengono archiviati su computer in conformità ai requisiti legali. Lo studio soddisfa la Dichiarazione di Helsinki ed è approvato dal comitato etico locale (reg.nr. 1-10-72-213-21). Per quanto riguarda le biopsie nasali, questo è un lavoro di routine negli ambulatori ORL. La biopsia viene prelevata dal turbinato medio in anestesia locale e misura 3x3x3 mm. Un'ulteriore richiesta di autorizzazione per ottenere le biopsie verrà inviata al comitato etico locale. Il rischio di sanguinamento è molto basso in quanto sono esclusi i pazienti con patologie ematologiche e i pazienti in terapia anticoagulante.

Il microbioma sarà valutato utilizzando tamponi prelevati dalla cavità nasale e analizzato utilizzando il sequenziamento di nuova generazione mirato all’RNA ribosomiale 16S e 18S presso il Dipartimento di batteri, parassiti e funghi dello Staten Serum Institute, Copenhagen, Danimarca.

Le biopsie nasali (3x3x3 mm) saranno caratterizzate istologicamente e analizzate utilizzando la trascrittomica spaziale sulla piattaforma Vision 10X Genomics. La secrezione nasale viene raccolta mediante sei tamponi e utilizzata per caratterizzare il profilo delle citochine.