La vitamina D può ridurre i danni al muscolo cardiaco dopo un intervento chirurgico di bypass?

Le iscrizioni sono iniziate a giugno 2018 e si sono concluse a dicembre 2018. I criteri di inclusione erano i seguenti: i pazienti sottoposti a bypass coronarico (CABG) elettivo e isolato mediante bypass cardiopolmonare (CPB) con carenza di vitamina D (definita come 25-idrossivitamina D [25(OH) D] < 20 ng/mL ) e funzionalità renale normale (creatinina <1,5 mg/dL). I criteri di esclusione erano: infarto miocardico recente, CABG urgente, chirurgia coronarica non isolata, chirurgia ripetuta, malattia maligna, presenza di malattie infiammatorie acute o croniche, storia di trattamento con vitamina D nei 6 mesi precedenti o riluttanza a partecipare.

Intervento Dopo il consenso informato, i partecipanti idonei allo studio sono stati assegnati in modo casuale (utilizzando un codice casuale generato dal computer) in un rapporto 1:1 a ricevere placebo o un totale di 450.000 unità internazionali (UI) di vitamina D3 (tre 50.000 UI di vitamina D3 compressa al giorno per 3 giorni) prima dell'operazione. Il gruppo placebo ha ricevuto tre compresse di farmaci inattivi al giorno nello stesso momento. Ad eccezione dei farmacisti, tutti i ricercatori, i pazienti e il team medico erano all'oscuro dell'assegnazione del gruppo.

Il bypass dell'arteria coronarica è stato eseguito nelle lesioni colpevoli per entrambi i gruppi da un'équipe chirurgica. Il protocollo standard per la gestione dell'anestesia generale, chirurgica e del CPB è stato eseguito per tutti i pazienti e sono già stati descritti in dettaglio [16].

Misure di esito L'esito primario era il grado di apoptosi cardiaca mediante misurazione dell'attività della caspasi 2, 3 e 7 dal campione atriale destro con colorazione immunoistochimica e il livello sierico di interleuchina-10 antinfiammatoria (IL-10) e crescita insulino-simile fattore (IGF-1) e peptide natriuretico cerebrale di tipo pro v N-terminale (nt-pro BNP). La biopsia dell'appendice atriale destra è stata prelevata al termine dell'intervento chirurgico dopo la rimozione della cannula venosa in modo non traumatico, conservata in formalina e parafinizzata in meno di 24 ore. I campioni di sangue sono stati raccolti al basale (T1), prima dell'induzione dell'anestesia (T2), alla fine dell'intervento chirurgico dopo l'inversione della protamina (T3) e il primo giorno postoperatorio (T4) per misurare il livello sierico di IGF-1, IL-10 e pro BNP. I campioni di sangue sono stati centrifugati a 2500 rpm per 15 minuti entro un'ora dal prelievo di sangue e il siero è stato conservato a -20°C fino al dosaggio.

Saggio di immunoassorbimento enzimatico La concentrazione di IL-10 è stata misurata mediante un kit ELISA quantitativo. La concentrazione dell'IGF-1 è stata misurata con un kit ELISA quantitativo.

La vitamina D sierica è stata rilevata utilizzando il metodo della cromatografia liquida ad alta prestazione. La misurazione pro BNP è stata eseguita utilizzando un test immunometrico chemiluminescente a due siti disponibile in commercio.

Studi di immunoistochimica La colorazione immunoistochimica è stata eseguita su sezioni spesse 5 micrometri. I vetrini sono stati incubati a 37°C per 24 ore e deparaffinati in xilene preriscaldato e reidratati attraverso gradi discendenti di alcool, lavati in acqua distillata. Il recupero dell'antigene indotto dal calore è stato effettuato mediante forno a microonde con tampone citrato (pH 6,0) per l'anti-caspasi-7 e l'acido etilendiammina tetraacetico; soluzione tamponata (Tris-EDTA) (pH=8) per anti-caspase-2 e 3. Il blocco dell'endoperossidasi è stato effettuato aggiungendo perossido di idrogeno sulle sezioni. Dopo aver aggiunto il blocco proteico per 5 minuti, i vetrini sono stati lavati in soluzione salina tamponata con Tris (TBS). L'anticorpo primario come anticorpo anti-caspasi-2, anticorpo monoclonale di coniglio, anti-caspasi-3, anticorpo monoclonale di coniglio, anti-caspasi-7 e anticorpo monoclonale di topo (clone 7-1-11, abcam) è stato aggiunto e conservato per 30 minuti, lavato in TBS. Sono stati utilizzati kit di micropolimeri di rilevazione immunoistochimica (IHC) specifici per topo e coniglio perossidasi di rafano/diaminobenzidina (HRP/DAB) e incubati per 15 minuti, quindi lavati con soluzione salina tamponata con tris (TBS). Il cromogeno diaminobenzidina (DAB) è stato aggiunto e mantenuto per 5 minuti. Vetrini lavati in acqua distillata e controcolorati con ematossilina. Le sezioni contenenti tessuto linfonodale sono state utilizzate come controllo positivo. Il controllo negativo includeva l'anticorpo primario sostituito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Le sezioni immunocolorate sono state riviste per l'espressione citoplasmatica di anti-caspase-2, anti-caspase-3 e anti-caspase-7. È stato contato il numero di cellule immuno-reattive per High Power Field (HPF) (X 400). A tale scopo sono stati valutati almeno 10 HPF ed è stata registrata la media delle cellule positive.

Dimensione del campione e metodi statistici La determinazione del numero di pazienti (30 pazienti per gruppo) si è basata su studi precedenti che hanno indagato l'attività della caspasi nell'ambito del CABG.

Le variabili categoriche sono state riportate come numeri e percentuali, mentre la media ± deviazione standard è stata espressa per le variabili continue. Sono state applicate misure ripetute di analisi della varianza e confronti multipli utilizzando la correzione di Bonferroni (correzione dell'errore di tipo I) per valutare il cambiamento dei marcatori infiammatori misurati tra i gruppi nel tempo. È stato eseguito il test di Kolmogorov-Smirnov per la normalità. Le variabili continue e le variabili categoriali sono state confrontate tra i gruppi utilizzando rispettivamente il test t di Student (o il test di Mann-Whitney per quelli che soddisfano una distribuzione anomala) e il chi-quadrato. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando SPSS versione 23 (SPSS, Chicago, IL, USA). Un valore p <0,05 è stato considerato significativo.