Czy witamina D może zmniejszyć uszkodzenie mięśnia sercowego po operacji bajpasów?

Rekrutacja rozpoczęła się w czerwcu 2018 roku i została zakończona w grudniu 2018 roku. Kryteria włączenia były następujące: pacjenci skierowani na planowe i izolowane pomostowanie aortalno-wieńcowe (CABG) z użyciem krążenia pozaustrojowego (CPB) z niedoborem witaminy D (zdefiniowanej jako 25-hydroksywitamina D [25(OH) D] < 20 ng/ml ) i prawidłowa czynność nerek (kreatynina <1,5 mg/dl). Kryteriami wykluczającymi były: niedawny zawał mięśnia sercowego, pilny CABG, nieizolowana operacja wieńcowa, powtórna operacja, choroba nowotworowa, obecność ostrych lub przewlekłych chorób zapalnych, historia leczenia witaminą D w ciągu ostatnich 6 miesięcy lub niechęć do udziału.

Interwencja Po wyrażeniu świadomej zgody kwalifikujący się uczestnicy badania zostali losowo przydzieleni (za pomocą wygenerowanego komputerowo losowego kodu) w stosunku 1:1 do grupy otrzymującej placebo lub łącznie 450 000 jednostek międzynarodowych (IU) witaminy D3 (trzy po 50 000 IU witaminy D3 tabletka dziennie przez 3 dni) przed operacją. Grupa placebo otrzymywała trzy tabletki nieaktywnego leku dziennie w tym samym punkcie czasowym. Z wyjątkiem farmaceutów wszyscy badacze, pacjenci i zespół medyczny byli zaślepieni co do przydziału do grup.

Pomostowanie aortalno-wieńcowe zostało wykonane w zmianach winowajczych w obu grupach przez jeden zespół chirurgiczny. Standardowy protokół znieczulenia ogólnego, postępowania chirurgicznego i CPB został wykonany u wszystkich pacjentów i został już szczegółowo opisany [16].

Miary wyników Pierwszorzędowym wynikiem był stopień apoptozy serca na podstawie pomiaru aktywności kaspazy 2, 3 i 7 z próbki prawego przedsionka z barwieniem immunohistochemicznym oraz poziom przeciwzapalnej interleukiny-10 (IL-10) w surowicy i wzrostu insulinopodobnego (IGF-1) i mózgowy peptyd natriuretyczny typu N-końcowego pro v (nt-pro BNP). Biopsję uszka prawego przedsionka pobrano pod koniec operacji po usunięciu kaniuli żylnej w sposób nieurazowy, przechowywano w formalinie iw czasie krótszym niż 24h parafinowano. Próbki krwi pobrano na początku badania (T1), przed indukcją znieczulenia (T2), pod koniec operacji po odwróceniu protaminy (T3) oraz w pierwszej dobie pooperacyjnej (T4) w celu oznaczenia stężenia IGF-1, IL-10 w surowicy i za BNP. Próbki krwi wirowano przy 2500 obr./min przez 15 minut w ciągu jednej godziny po pobraniu krwi, a surowicę przechowywano w temperaturze -20°C do czasu oznaczenia.

Test immunoenzymatyczny Stężenie IL-10 mierzono za pomocą ilościowego zestawu ELISA. Stężenie IGF-1 mierzono za pomocą ilościowego zestawu ELISA.

Stężenie witaminy D oznaczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Pomiaru pro BNP dokonano przy użyciu dostępnego w handlu chemiluminescencyjnego testu immunometrycznego z dwoma ośrodkami .

Badania immunohistochemiczne Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono na skrawkach o grubości 5 mikrometrów. Szkiełka inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny i odparafinowano we wstępnie ogrzanym ksylenie i ponownie uwodniono alkoholem o malejącym stężeniu, przemyto wodą destylowaną. Indukowane ciepłem odzyskiwanie antygenu przeprowadzono w kuchence mikrofalowej z buforem cytrynianowym (pH 6,0) dla anty-kaspazy-7 i kwasu etylenodiaminotetraoctowego; buforowany roztwór (Tris-EDTA) (pH=8) dla anty-kaspazy-2 i 3. Blokowanie endoperoksydazy wykonano przez dodanie nadtlenku wodoru na skrawki. Następnie dodano blok białkowy na 5 minut, szkiełka przemyto w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS). Dodano przeciwciało pierwszorzędowe jako przeciwciało przeciw kaspazie-2, królicze przeciwciało monoklonalne, przeciwciało przeciw kaspazie-3, królicze przeciwciało monoklonalne, przeciwciało przeciw kaspazie-7 i mysie przeciwciało monoklonalne (klon 7-1-11, abcam) i trzymano je przez 30 minut, przemyto w TBS. Wykrywanie immunohistochemiczne (IHC) swoistej dla myszy i królika peroksydazy chrzanowej/diaminobenzydyny (HRP/DAB) Zastosowano zestaw mikropolimerowy i inkubowano przez 15 minut, a następnie przemyto solą fizjologiczną buforowaną tris (TBS). Dodano chromogen diaminobenzydyny (DAB) i trzymano przez 5 minut. Szkiełka przemyto wodą destylowaną i barwiono kontrastowo hematoksyliną. Skrawki zawierające tkankę węzłów chłonnych zastosowano jako kontrolę pozytywną. Kontrola negatywna obejmowała pierwotne przeciwciało zastąpione solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Skrawki wybarwione immunologicznie poddano przeglądowi pod kątem cytoplazmatycznej ekspresji antykaspazy-2, antykaspazy-3 i antykaspazy-7. Zliczono liczbę komórek immunoreaktywnych na pole o dużej mocy (HPF) (X 400). W tym celu oceniono co najmniej 10 HPF i zarejestrowano średnią komórek dodatnich.

Wielkość próby i metody statystyczne Określenie liczby pacjentów (30 pacjentów na grupę) oparto na wcześniejszych badaniach oceniających aktywność kaspazy w warunkach CABG.

Zmienne kategoryczne podano w postaci liczbowej i procentowej, podczas gdy średnia ± odchylenie standardowe wyrażono dla zmiennych ciągłych. Do oceny zmiany mierzonych markerów stanu zapalnego pomiędzy grupami w czasie zastosowano powtarzane pomiary analizy wariancji i wielokrotne porównania z zastosowaniem poprawki Bonferroniego (korekcja błędu typu I). Przeprowadzono test normalności Kołmogorowa-Smirnowa. Zmienne ciągłe i zmienne kategoryczne porównano między grupami, stosując odpowiednio test t-Studenta (lub test Manna-Whitneya dla tych, które spełniają rozkład nieprawidłowy) i chi-kwadrat. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu SPSS wersja 23 (SPSS, Chicago, IL, USA). Za istotne uznano wartości p <0,05.