Interazioni cellule immunitarie polmonari-microbioma nell'ARDS (ILLUMINA-1)

L'iperinfiammazione polmonare con invasione di neutrociti e macrofagi e la deplezione delle cellule T sono caratteristiche comuni della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), ma resta da chiarire se le cellule T nei polmoni dei pazienti con ARDS siano iperattivate e/o esaurite, e in che misura ciò contribuisce all'invasione dei neutrociti e quindi alla distruzione del tessuto polmonare. Inoltre, il microbioma polmonare ha mostrato una riduzione della diversità e delle interazioni nell'ARDS, che può essere importante per la normale funzione delle cellule T. Al momento, le interazioni cellule immunitarie-microbioma e la loro relazione con la gravità e la progressione della malattia non sono state ancora studiate nell'ARDS.

Disegno generale In 20 pazienti ventilati meccanicamente con ARDS da assente a lieve e 20 con ARDS non COVID-19 da moderata a grave secondo la definizione di Berlino, si otterranno un aspirato endotracheale e un fluido BAL (BALF) da segmenti polmonari separati. Inoltre, verranno raccolti un tampone orale e nasale e campioni di sangue. Ciò avverrà entro 72 ore dall'intubazione e di nuovo dopo 7-10 giorni se il paziente è ancora intubato.

Cartella sanitaria elettronica del paziente Dopo l'inserimento si ottengono: codici diagnostici e farmaci (tipologia e posologia, inclusi vasopressori e sedativi) e storia del fumo (attuale/precedente/non fumatore; pack anni); orario di ingresso; pressione sanguigna, ritmo cardiaco e frequenza cardiaca, temperatura, impostazioni del ventilatore, terapia di supporto (dialisi, ECMO), risultati degli esami del sangue al momento del ricovero e nei giorni dello studio (conta delle cellule del sangue, parametri della coagulazione, pannello renale, epatico ed elettrolitico; emogasanalisi venosa mista); punteggi clinici al ricovero e nei giorni di studio (SAPS3, APACHE II, SOFA), morte entro 30 giorni

Prelievo di sangue I campioni di sangue arterioso vengono prelevati dal catetere arterioso invasivo del paziente (inserito al momento del ricovero in terapia intensiva per scopi clinici: per il monitoraggio continuo della pressione arteriosa invasiva e l'emogasanalisi arteriosa ripetuta) immediatamente prima del prelievo del BALF.

Broncoscopia con raccolta BALF Questa procedura viene eseguita in modo standardizzato secondo le attuali linee guida cliniche. Immediatamente prima della procedura, si ottengono un tampone orale, un tampone nasale e un aspirato endotracheale (ETA). La FIO2 viene quindi aumentata a 1,0 e la procedura di broncoscopia viene eseguita utilizzando un videoscopio monouso con un diametro esterno di 5,0 mm). Tre successive aliquote da 50 ml di soluzione salina isotonica preriscaldata (37°C) vengono instillate nel segmento mediale del lobo medio destro, aspirate immediatamente con bassa pressione di aspirazione negativa (< 100 cm H2O) e riunite in un contenitore di vetro sterile su ghiaccio per ottenere un campione BALF.

Successivamente viene eseguito un mini-BAL nel lobo superiore e inferiore del polmone destro con un'unica installazione di 20 ml di soluzione fisiologica isotonica in ciascun lobo con aspirazione immediata in un contenitore sterile.

Misure La composizione della popolazione di cellule immunitarie, così come la funzione e la differenziazione di varie linee cellulari saranno studiate mediante sequenziamento dell'RNA di singola cellula (scRNA-seq) su cellule immunitarie selezionate da BALF, ETA e sangue, e questo sarà integrato dal sequenziamento di massa dell'RNA con codici a barre e multiplexing del campione, fornendo un modello di espressione dettagliato di tutti i campioni.

La composizione del microbioma in BALF, ETA e tamponi orali sarà valutata mediante sequenziamento mirato dell'amplicone delle regioni ipervariabili da 1 a 3 della subunità 16S del gene dell'RNA ribosomiale per i batteri.

Le analisi statistiche saranno eseguite utilizzando il software statistico R versione 4.1.1 (R Project for Statistical Computing) all'interno del software statistico RStudio versione 1.4.1717 (RStudio) e p<0,05 considerati statisticamente significativi. L'ispezione della normalità e dell'omogeneità della varianza sarà effettuata creando qq-plot e istogrammi. Verranno utilizzati gli strumenti di inferenza statistica SPIEC-EASI e HeatMaps e, sulla base di analisi correlazionali, verranno applicate analisi dei componenti principali, inclusa l'analisi dei cluster non gerarchici, per identificare i tratti nei due gruppi.