Wpływ azytromycyny jako środka wspomagającego skaling i planowanie korzeni w leczeniu zapalenia przyzębia

Kliniczne badania periodontologiczne Parametry przyzębia oceniano na etapie przed leczeniem (T0) oraz 4 tygodnie ±5 dni po zakończeniu SRP. W przypadku wszystkich uczestników zarejestrowano płeć i wiek oraz zbadano parametry przyzębia, takie jak głębokość kieszonek przyzębnych (PPD), kliniczna utrata przyczepu (CAL) i krwawienie podczas sondowania (BoP). Wszystkie pomiary zostały przeprowadzone przez jednego wykalibrowanego egzaminatora przy użyciu ręcznej sondy periodontologicznej (0106.DT06.CP10, Den Tag, Włochy). PPD i CAL zmierzono w sześciu miejscach przyzębia wokół każdego zęba (w tym trzecich zębów trzonowych) z dokładnością do 1 mm i wzięto pod uwagę wartości maksymalne. U uczestników grupy H wykluczono objawy zapalenia dziąseł, głębokość sondowania przekraczającą 3 mm oraz BoP, aby zapewnić zdrowie przyzębia.

Terapia periodontologiczna obejmowała instruktaż higieny jamy ustnej w domu oraz SRP. Wykonano ją za pomocą ultradźwięków, kiret Gracey oraz polerowania pneumatycznego. Środek kontroli zgodności obejmował liczenie tabletek i kontrolę higieny w domu.

Pobieranie próbek tkanek dziąseł W celu dokładnego badania immunohistochemicznego pobrano wycinki z biopsji dziąseł, około 3x3 mm po znieczuleniu miejscowym od wszystkich uczestników bez szkody, podczas odpowiednich zabiegów stomatologicznych. Biopsja dziąsła dotkniętego zapaleniem przyzębia wykonana przed leczeniem (T0, grupa P) i 4 tygodnie ±5 dni po zakończeniu leczenia periodontologicznego, w tych samych lub najbliższych punktach, z pojedynczego najpoważniejszego klinicznie odpowiedniego miejsca wokół wspólnych zębów i przyzębia zabiegi takie jak ekstrakcje zębów z powodu powikłań próchnicy oraz gingiwektomie. Biopsje od pacjentów zdrowych przyzębia uzyskano podczas ekstrakcji zęba z powodu powikłań próchnicowych, zębów mądrości oraz wskazań ortodontycznych. Po pobraniu połowę biopsji utrwalono w 4% roztworze formaliny na 24 godziny utrwalania, odwodniono i zatopiono w parafinie, a drugą połowę przygotowano do oznaczenia cytokin.

Immunohistochemia i przeciwciała Skrawki parafinowe o grubości 2-3 μm odparafinowano i odwodniono. Wywołane ciepłem odzyskiwanie epitopów w buforze cytrynianowym, pH 6, przeprowadzono przez ogrzewanie szkiełek w kuchence mikrofalowej przez 23 minuty, następnie pozostawiono do ostygnięcia, przepłukano solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), inkubowano z zablokowanym odczynnikiem, przepłukano i inkubowano z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi makrofagów CD68 (1:30, klon PG-M1, Diagnostic BioSystems, Haga, Holandia) lub anty-CD163 (1:100, klon 10D6, Diagnostic BioSystems, Haga, Holandia). Następnie skrawki barwiono 2-etapowym plus mysz/królik PolyVueTM HRP/DAB Detection System (Diagnostic BioSystems, Haga, Holandia) i barwiono kontrastowo hemalaunem Mayera. PBS zastosowano jako kontrolę negatywną, tkankę węzłów chłonnych - jako kontrolę pozytywną.

Ocena barwienia immunohistochemicznego Makrofagi СD68+ i CD163+ oszacowano przez 400-krotne zliczenie liczby komórek pod mikroskopem świetlnym w obszarach intensywnego naciekania komórek, wybrano 5 regionów z każdego skrawka i wszystkie 5 zliczeń pobrano do dalszych statystyk. Liczono immunopozytywne Mφ w obszarach nacieku komórkowego, ze względu na bezpośredni związek ze stanem zapalnym. Liczbę komórek na 10 000 μm2 obliczono jako gęstość komórek immunopozytywnych. Zdjęcia i obliczenia uzyskano przy użyciu mikroskopu świetlnego Axio Lab.A1 (Carl Zeiss, Getynga, Niemcy) (×400).

Hodowla tkanek Część próbek tkanek dziąseł hodowano w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C iw obecności 5% CO2. Biopsje hodowano w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) uzupełnionej 10% (obj./obj.) płodową surowicą bydlęcą (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Gibco™, USA), 1% (obj./obj.) USA) i 0,2% (obj./obj.) fungizonu amfoterycyny B (Gibco™, USA) przez 48 godzin [16]. Do hodowli, każdą próbkę biopsyjną umieszczono w oddzielnej studzience 24-studzienkowej płytki Costar® (Corning Incorporated - Life Sciences, Kennebunk, USA), zawierającej 0,4 ml uzupełnionego DMEM. Po inkubacji tkanki usunięto i pożywkę hodowlaną odwirowano przy 800 gi 4°C.

Test cytokin Test cytokin w pożywce do hodowli tkankowej przeprowadzono metodą ELISA. Stężenia IL1-β, IL-6, IL-10 i TGF-β mierzono za pomocą dostępnych w handlu zestawów (Vector Best, Nowosybirsk, Rosja i MyBioSource, San Diego, USA). Stężenia cytokin wyrażono zgodnie z zaleceniami producenta.

Analiza statystyczna Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA) za pomocą nieparametrycznych (statystyki opisowe, test par dopasowanych Wilcoxona ze znakami rang – dla porównania wyników zależnych, test Manna-Whitneya – dla niezależnych grupy; nieparametryczna ANOVA dla wielokrotnych porównań z testami post-hoc i korelacja Spearmen). Stosunek CD68+/CD163+ oceniono za pomocą porównań międzygrupowych i sprawdzenia korelacji Spearmana. We wszystkich analizach wartości P <0,05 uznano za istotne statystycznie. W przypadku statystyk opisowych liczb komórek zastosowano również zakresy percentylowe ze względu na nienormalne rozkłady zmiennych.