Skuteczność wstępnie kondycjonowanych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w przeszczepie tłuszczu

Ludzka podskórna tkanka tłuszczowa wraz ze świadomymi zgodami zostanie pobrana do pojemnika lipoaspiracyjnego lub strzykawek B.D. o pojemności 20 cm3 w sterylnych warunkach podczas zabiegu. Pobieranie aspiratu tłuszczu będzie oparte na pewnych kryteriach selekcji, w tym na wstępnej rejestracji pacjentów bez cukrzycy, z ujemnym statusem wirusowym. Komórki macierzyste pochodzenia tłuszczowego (ASC) zostaną wyizolowane z tkanki tłuszczowej w sterylnych warunkach aseptycznych. Najpierw pojemnik z lipoaspiratem zostanie otwarty w szafce bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie odsączy się krew za pomocą pipety serologicznej. Następnie tłuszcz zostanie trzykrotnie przemyty 1X roztworem buforu fosforanowego (PBS) zawierającym antybiotyk i roztwór przeciwgrzybiczny, w celu pozbycia się naczynek, włosów i innych rodzajów tkanki łącznej. Następnie tkankę trawi się enzymatycznie roztworem kolagenazy typu I (1 mg/ml przygotowanym w pożywce Eagle'a o niskiej zawartości glukozy Dulbecco's Modified (LG-DMEM) i inkubuje przez 45 minut w temperaturze 37°C na wytrząsarce. Po trawieniu enzym będzie inaktywowany przez LG-DMEM z dodatkiem 5% świeżo wyizolowanej surowicy ludzkiej i wirowanie przy 1200 obr./min przez 10 minut. Po odwirowaniu tłuszcz zostanie odrzucony, a infranatant zostanie przepuszczony przez sita do komórek 100 µm w celu usunięcia resztek. Przesącz będzie ponownie wirowany przez 8 minut przy 1200 obr./min. Osad ponownie zawiesza się i umieszcza na płytkach w sterylnej kolbie T-75 cm2 zawierającej 10 ml LG-DMEM uzupełnionej 5% surowicą ludzką. Kolbę umieszcza się w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C, 5% dwutlenku węgla (CO2). Pożywki będą uzupełniane co trzeci dzień, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji. Komórki w stadium P2-P3 zostaną użyte w tym badaniu do immunocytochemii, a także do interwencji. W celu wstępnego kondycjonowania ASC będą inkubowane z wstępnie kondycjonowaną pożywką kurkuminy przez 24 godziny. Jałowość i żywotność komórek zostanie oceniona przed przeszczepem. Do przeszczepu 1 000 000 komórek na ml tłuszczu zostanie zmieszanych, przeniesionych do strzykawek o pojemności 10 cm3 i wstrzykniętych w miejsce deformacji. Ilość tkanki tłuszczowej zostanie ustalona przez klinicystę na podstawie asymetrii twarzy.