Biomarcador Epigenético para Osteossarcoma

O investigador deseja inscrever 100 participantes com osteossarcoma inicialmente tratados no Centro de Tumores Musculoesqueléticos do Hospital Popular da Universidade de Pequim (PKUPH). Todos esses participantes seguirão o quimioprotocolo para osteossarcoma em PKUPH. 8 ml de sangue periférico seriam coletados antes de cada ciclo de quimioterapia para análise posterior. Após a cirurgia definitiva, os participantes precisarão colher 8ml de sangue periférico a cada 2 meses durante 6 meses. Um total de 6 vezes de coleta de sangue precisará ser feito.

Na abordagem hMe-Seal, o sangue periférico é coletado em Vacutainers revestidos com EDTA. O plasma é coletado das amostras de sangue após centrifugação a 1 600 × g por 10 min a 4 ° C e 16 000 × g a 10 min a 4 ° C. O CfDNA é extraído usando o Kit de Ácido Nucleico Circulante (QIAGEN). Depois disso, o cfDNA (1-10 ng) é reparado na extremidade, 3'-adenilado e ligado a DNA Barcodes usando o kit KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems). O DNA ligado é incubado em uma solução contendo tampão HEPES, UDP-6-N3-Glc e βGT. Depois disso, DBCO-PEG4-biotina é adicionado diretamente à mistura de reação. Em seguida, o DNA é purificado por Micro Bio-Spin 30 Column (Bio-Rad). O DNA purificado é incubado com esferas de estreptavidina M270 (Life Technologies) em tampão específico. As esferas são subseqüentemente submetidas a três lavagens de 5 minutos cada uma com quatro tipos de tampões diferentes. Toda a encadernação e lavagem são feitas em temperatura ambiente com rotação suave. As esferas são então ressuspensas em água e amplificadas com 16 ciclos de amplificação por PCR. Os produtos de PCR são purificados usando grânulos AMPure XP. O sequenciamento de 38bp de extremidade de par é realizado no instrumento NextSeq-500.