Aperfeiçoamento em DIAgnóstico e Estudos de Correlação Fenótipo-genótipo em Pacientes com MIOPATIA com Suspeita de TITinopatia (DIAMYOTIT)

As titinopatias são miopatias esqueléticas e cardíacas hereditárias devido à alteração da titina, uma proteína elástica gigante do sarcômero. Devido ao uso generalizado de sequenciamento de próxima geração (NGS), o gene titina (TTN) está emergindo como um dos principais genes causadores de distúrbios neuromusculares (DNMs), com alta heterogeneidade clínica e alélica. Os mecanismos subjacentes à variabilidade fenotípica e ao modo de herança recessivo ou dominante das titinopatias são pouco compreendidos. Envolvem as funções estruturais primordiais da titina na formação e estabilidade do sarcômero, bem como suas interações com outras proteínas. Os efeitos das variantes no TTN são variáveis, silenciosos, recessivos ou dominantes, e as ferramentas de bioinformática não são realmente eficientes para a interpretação de seu impacto funcional, tornando-os extremamente difíceis de interpretar. Além disso, as variantes TTN são muito frequentes na população em geral. Devido ao enorme tamanho (3700kD) e complexidade da titina, as análises das consequências das variantes TTN em transcritos e proteínas não são realizadas comumente. Existem poucas equipes na comunidade internacional, mas nenhuma equipe na França, que propõe análises de Western-blot (WB) na titina como teste diagnóstico. Além disso, este teste permite confirmar o diagnóstico apenas para titinopatias recessivas por mutações truncadas, que são situações raras (

Este projeto vem de nossos resultados de diagnóstico NGS e será a continuação de um projeto financiado pela AFM em andamento (aplicação 19958). Identificamos por NGS, em pacientes com miopatia esquelética (com ou sem cardiomiopatia), várias variantes de TTN potencialmente causadoras de doença. Graças ao projeto financiado pela AFM, analisamos as consequências de algumas variantes do TTN no splicing e atualmente estamos implementando condições experimentais para realizar o titin WB. Além disso, observamos que a maioria das variantes não truncadas em TTN suspeitas de serem patogênicas estão localizadas em domínios de titina interagindo com a cadeia pesada de miosina (MHC). Na hipótese de que possam ter efeitos deletérios na estabilidade das interações entre titina e MHC no sarcômero, planejamos implementar testes funcionais para avaliar suas consequências nas interações titina-miosina.

Os objetivos específicos do presente projeto serão a implementação de estudos funcionais para avaliar o efeito das variantes TTN nos transcritos e na proteína, a fim de melhorar a abordagem diagnóstica e realizar estudos de correlação com os modos de herança e os fenótipos. O aspecto inovador do projeto é a combinação de várias abordagens moleculares e bioquímicas no RNA (avaliação dos efeitos na transcrição e/ou splicing em transcritos de titina no músculo esquelético de pacientes), proteína (avaliação dos efeitos de todas as variantes de TTN na quantidade de titina e tamanho, por análises de WB em biópsias musculares) e interações proteína-proteína (avaliação do impacto patogênico de variantes TTN localizadas em domínios de interação titina-MHC em interações com MHC), que implementaremos com base em tecnologias relatadas em projetos de pesquisa acadêmica . A força do nosso projeto também se baseia na nossa robusta rede com neurologistas, neuropediatras, patologistas e outros especialistas em biologia, dentro da organização em um centro de referência inter-regional de DNMs e em uma rede nacional de titinopatias, e a implicação no projeto de um neurologista (Dr. Morales) através de sua tese de doutorado, para realizar estudos de correlações fenótipo-genótipo.

Estudos funcionais das variantes identificadas no gene TTN devem ter forte impacto no diagnóstico dos pacientes, o que é importante para seu manejo e aconselhamento genético familiar. Os testes implementados estarão disponíveis para a rede francesa de titinopatias. Isso deve resolver o diagnóstico de um grande número de pacientes sem diagnóstico claro e especificar a frequência do envolvimento de titinopatias nas miopatias. A melhoria do diagnóstico das titinopatias terá altos impactos socioeconômicos porque reduzirá o custo devido a testes diagnósticos iterativos.

Os estudos de correlação fenótipo-genótipo permitirão ampliar o espectro mutacional e clínico das titinopatias e participar do esforço internacional de compreensão das bases moleculares das titinopatias, primeiro passo obrigatório para a definição de abordagens terapêuticas. Além disso, a confirmação genética abre caminho para o desenvolvimento de modelos celulares de titinopatia, derivados de tecidos de pacientes. Esses modelos servirão de base para estudos proteômicos e outros estudos funcionais para decifrar os mecanismos das titinopatias e apontar vias metabólicas que possam ser alvo de terapêutica farmacológica.

Por estas razões, a presente aplicação constituirá um desenvolvimento importante, original e inovador para contribuir para o diagnóstico e para o conhecimento das bases moleculares das titinopatias.