Estado de saúde após troca de inibidores da enzima de conversão de angiotensina ou bloqueadores de receptores de angiotensina para sacubitril-valsartana em pacientes com insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida da Tanzânia rural: um estudo intervencionista (ARNI-TZ)

Contexto As doenças não transmissíveis (DNT) causam mais de 40 milhões de mortes em todo o mundo todos os anos, e mais de três quartos delas ocorrem em países de baixo e médio rendimento. A maioria das mortes é causada por doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca e acidente vascular cerebral (1). Foi relatado que a mortalidade por insuficiência cardíaca é mais elevada em África, com uma taxa de mortalidade num ano de 34%, em comparação com 16,5% noutros países de baixo e médio rendimento (2). A hipertensão arterial é o factor de risco subjacente mais comum para a insuficiência cardíaca na África Subsariana, também nas zonas rurais (3, 4). Os pacientes apresentam-se principalmente em estágios avançados de insuficiência cardíaca e não estão sob tratamento regular (4). As diretrizes internacionais recomendam diuréticos, inibidores da enzima de conversão da angiotensina (ECA) ou inibidores da angiotensina-neprilisina (ARNI), bloqueadores dos receptores da angiotensina 2 (BRA), se os inibidores da ECA não forem tolerados, betabloqueadores, antagonistas dos receptores mineralocorticóides e co-transportador de glicose e sódio. 2 (SGLT-2) inibidores para tratamento de insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção reduzida (5). Uma estratégia de tratamento intensivo com rápida titulação da terapia para insuficiência cardíaca crônica orientada pelas diretrizes após insuficiência cardíaca aguda reduz os sintomas, melhora a qualidade de vida, reduz o risco de morte por todas as causas e é bem tolerada. (6, 7). O estudo PARADIGM mostrou que, se o enalapril 10mg duas vezes ao dia durante pelo menos 2 semanas fosse trocado por sacubitril-valsartana em pacientes sintomáticos com fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) ≤40% que estavam sob terapia estável para insuficiência cardíaca há pelo menos 4 semanas, o desfecho combinado de morte e hospitalização por insuficiência cardíaca foi significativamente reduzido de 26,5% para 21,8% em comparação com se o inibidor da ECA fosse continuado (8). No CHAMP-HF, um estudo observacional multicêntrico de pacientes ambulatoriais americanos com insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (ICFEr), 35,8% dos pacientes iniciados em ARNI tiveram um grande (10 a <20 pontos) ou muito grande (20 pontos e mais de 100) melhoria no seu estado de saúde expressa pela pontuação resumida do Kansas City Cardiomyopathy Questionnaire (KCCQ) acima de uma mediana (IQR) de 10,7 (6,7 -11,7) meses de acompanhamento, vs 27,5% dos pacientes que não iniciaram ARNI (9, 10). Entre os pacientes com ICFEr que foram hospitalizados por insuficiência cardíaca aguda descompensada, o início da terapia com sacubitril/valsartan levou a uma redução maior na concentração sanguínea do pró-peptídeo natriurético cerebral N-terminal (NT-proBNP) do que a terapia com enalapril (11). Um estudo não conseguiu detectar quaisquer diferenças raciais e étnicas na redução do NT-proBNP, na melhoria do estado de saúde e na remodelação reversa em pacientes com insuficiência cardíaca sistólica tratados com sacubitril/valsartan (12). Em pacientes com hipertensão sensível ao sal, o sacubitril/valsartan foi superior ao valsartan no controle da pressão arterial em consultório e ambulatorial e foi associado a um aumento na natriurese e na diurese (13). Além disso, o sacubitril/valsartana teve um efeito positivo no controle glicêmico de pacientes com insuficiência cardíaca e diabetes mellitus (14). Teve efeito semelhante na função renal e na albuminúria em pacientes com insuficiência renal crônica em comparação ao irbesartan (15).

No ensaio PARADIGM, os participantes foram recrutados também na África do Sul (8). Contudo, nenhum dos outros estudos foi realizado em África, e a eficácia e segurança do sacubitril/valsartan nunca foram estudadas em doentes africanos fora da África do Sul. Sacubitril/valsartan está registrado na Tanzânia sob o nome de produto Uperio®.

Hipótese: Nossa hipótese é que a mudança de um inibidor da ECA ou BRA bem dosado para sacubitril/valsartana leva a uma melhora do estado de saúde, a um aumento na distância percorrida em 6 minutos de caminhada e a uma redução do peptídeo natriurético cerebral ( concentração sanguínea de BNP), em pacientes sintomáticos com insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (ICFEr) da África Subsaariana que estão sob terapia estável para insuficiência cardíaca crônica.

Métodos Desenho do estudo Este é um estudo intervencionista pré-pós de centro único com acompanhamento de 10 meses.

Ambiente O estudo será realizado no Hospital Regional de Referência St Francis, Ifakara. Este hospital é um centro de referência para uma população de cerca de 1 milhão de pessoas que vivem no vale de Kilombero, na zona rural da Tanzânia. Desde 2021, uma Clínica de Coração e Pulmão atende anualmente 5.000 pacientes com doenças cardíacas ou pulmonares. Ecocardiografia abrangente, eletrocardiografia, ultrassonografia pulmonar e exames laboratoriais são realizados rotineiramente por uma equipe treinada. Uma coorte de pacientes incluindo mais de 780 pacientes foi estabelecida. Sacubitril/valsartana ainda não é prescrito para pacientes atendidos na clínica. O laboratório do hospital oferece química incluindo a dosagem sérica de BNP rotineiramente. Há uma fábrica de oxigênio, um pronto-socorro que atende 90.000 pacientes por ano e uma unidade de alta dependência que atende 500 pacientes por ano neste hospital.

Objetivos de estudo

Objetivo principal Determinar a proporção de participantes que obtiveram uma melhora grande (≥10 pontos) ou muito grande (≥20 pontos) na pontuação resumida do Kansas City Cardiomyopathy Questionnaire (KCCQ) (mínimo 0, máximo 100) (9), em 5 semanas, 2, 4, 6 e 10 meses após a mudança de um inibidor da ECA para sacubitril-valsartana em participantes sintomáticos com insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (ICFEr) sob terapia estável para insuficiência cardíaca.

Objetivos secundários

• 1. Para determinar as alterações na pontuação resumida do KCCQ, as alterações nas classes I a IV da New York Heart Association (NYHA) e as alterações na distância percorrida no teste de caminhada de 6 minutos desde o início até 5 semanas, 2, 4 , 6 e 10 meses
• 2. Para determinar a alteração da concentração sérica de BNP desde o início até 10 meses
• 3. Para determinar a alteração da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) desde o início até 6 e 10 meses
• 4. Para determinar a proporção de participantes que alcançaram pressão arterial bem controlada (ou seja, <140/90 mmHg) após 2 semanas, 5 semanas e 2, 4, 6 e 10 meses
• 5, Para determinar a frequência de morte, perda de acompanhamento e hospitalização no período de acompanhamento de 10 meses.
• 6. Para determinar a frequência de hipercalemia, declínio da função renal, hipotensão arterial e angioedema

Resultados

Resultado primário:

Proporção de participantes com uma pontuação resumida do KCCQ grande ou muito grande melhorada

Resultados secundários;

1. Pontuação resumida do KCCQ, classificação NYHA, distância percorrida no teste de caminhada de 6 minutos
2. Concentração sérica de BNP
3. FEVE
4. Proporção de participantes com pressão arterial controlada

5. Número de internações, óbitos e perdas de seguimento.

   Resultados de segurança:

6. Número de participantes com hipercalemia, insuficiência renal (definida como uma diminuição na taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) de pelo menos 50% ou uma diminuição de pelo menos 30ml por minuto por 1,73m2 desde o momento da inscrição para menos de 60ml por minuto ( 8)) hipotensão (pressão arterial sistólica <90 mmHg) e angioedema.

Participantes do estudo: Critérios de inclusão e exclusão Serão elegíveis os pacientes adultos que visitarem a clínica de coração e pulmão em Ifakara. Todos os participantes assinarão um termo de consentimento livre e esclarecido.

Critérios de inclusão Adultos sintomáticos (≥18 anos) com insuficiência cardíaca classe II-IV da NYHA e FEVE ≤40%, tratados com inibidor da ECA ou BRA, betabloqueador e espironolactona nas dosagens recomendadas por pelo menos 3 meses, e adesão a esta terapia de pelo menos 80%.

Critérios de exclusão Gravidez, pressão arterial sistólica inferior a 95 mmHg, TFGe abaixo de 30 ml por minuto por 1,73 m2 de área de superfície corporal, nível sérico de potássio superior a 5,4 mmol por litro ou história de angioedema ou efeitos colaterais inaceitáveis ​​antes durante recebimento de inibidores da ECA ou BRA (8); Incapacidade de assinar o termo de consentimento livre e esclarecido.

Tamanho da amostra O cálculo do tamanho da amostra é baseado nos resultados de Thomas et al. (10) que relataram que 35,8% dos pacientes que receberam ARNI experimentaram uma melhora grande (≥10 pontos) ou muito grande (≥20 pontos) na pontuação resumida do KCCQ, em comparação com 27,5% dos pacientes que não iniciaram a terapia com ARNI. Com base nesses tamanhos de efeito, calculamos que seria necessário um tamanho de amostra de 238 pacientes para detectar uma diferença estatisticamente significativa com poder de 80% e um teste bilateral com nível de significância de 5%, representando uma taxa de mortalidade esperada de 25%. ou perda de acompanhamento.

Justificativa da escolha da população do estudo Para este estudo, escolhemos critérios de inclusão e exclusão semelhantes que foram usados ​​no grande estudo PARADIGM mostrando um benefício do sacubitril/valsartan.

Procedimentos do estudo Os pacientes serão selecionados na Clínica Coração e Pulmão do Hospital Regional de Referência St Francis, e os participantes já incluídos na coorte de pacientes da Clínica Coração e Pulmão serão contatados e convidados a participar. Antes da inscrição, a medicação para insuficiência cardíaca de pacientes potencialmente elegíveis será otimizada (ou seja, diuréticos adaptados ao status do volume, inibidores da ECA ou BRA, betabloqueadores e espironolactona aumentados para altas doses terapêuticas (lisinopril para pelo menos 10 mg uma vez ao dia ou enalapril pelo menos 10 mg duas vezes por dia, losartana pelo menos 50 mg uma vez ao dia, carvedilol pelo menos 12,5 mg duas vezes ao dia ou bisoprolol pelo menos 5 mg uma vez diariamente e espironolactona pelo menos 25 mg uma vez ao dia). A adesão será avaliada por contagem de comprimidos e autorrelato.

Pacientes com insuficiência cardíaca recém-diagnosticados e não tratados iniciarão terapia para insuficiência cardíaca, serão rapidamente titulados (6) e convidados a serem reavaliados para inscrição após 3 meses. Na inscrição, os pacientes assinarão um consentimento informado e serão instruídos a continuar a aderir à terapia prescrita. Os seguintes exames de base serão feitos: anamnese incluindo adesão à medicação, exame físico incluindo medição padronizada de pressão arterial (16) e saturação de oxigênio, pontuação resumida (KCCQ) (9), ecocardiografia abrangente, eletrocardiografia e teste de caminhada de 6 minutos serão ser feito de acordo com procedimentos operacionais padrão. Amostras de sangue para hemoglobina, glicose aleatória, BNP, creatinina, enzimas hepáticas, HIV e eletrólitos (potássio, sódio, cálcio) serão coletadas. Será feita uma eliminação de 36 horas dos inibidores da ECA antes de iniciar o ARNI, devido ao risco de angioedema se o ARNI for iniciado sem um período de eliminação. O inibidor da ECA ou BRA será trocado para sacubitril/valsartana 50 mg duas vezes ao dia (24,3 mg de sacubitril, 25,7 mg de valsartana) por duas semanas, aumentado para 100 mg duas vezes ao dia durante três semanas, seguido de 200 mg duas vezes ao dia (17). O betabloqueador e a espironolactona serão continuados e as dosagens dos diuréticos serão adaptadas conforme indicação clínica. As visitas de acompanhamento serão feitas após 2 semanas, 5 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses e 10 meses após a mudança para sacubitril/valsartana, incluindo anamnese e exame físico. A adesão à medicação será avaliada pela contagem de comprimidos e autorrelato. A pontuação resumida do KCCQ e o teste de caminhada de 6 minutos serão realizados após 5 semanas, 2, 4, 6 e 10 meses, a creatinina e os eletrólitos serão medidos no soro após 5 semanas e após 4 e 10 meses, e BNP após 10 meses de acompanhamento.

A ecocardiografia será realizada nas visitas de acompanhamento de 6 e 10 meses. O ecocardiografista que faz a ecocardiografia de acompanhamento não terá conhecimento do resultado do ecocardiograma inicial (Figura 1). O custo da medicação de rotina para insuficiência cardíaca direcionada pelas diretrizes (diuréticos, inibidores da ECA, BRA, betabloqueador, espironolactona) será coberto pelo seguro saúde ou pelo participante. Sacubitril-valsartan será fornecido pela Novartis. Os custos de transporte para as visitas de acompanhamento serão reembolsados. Após o final do estudo, sacubitril/valsartan estará disponível para os pacientes por um preço comparável aos inibidores da ECA disponíveis localmente.

Figura 1: Momentos de inscrição, visitas de acompanhamento e testes realizados.

Análise estatística A análise estatística descritiva será usada para descrever resultados primários e secundários. Calcularemos a proporção de participantes com uma melhoria grande (≥10 pontos) ou muito grande (≥20 pontos) na pontuação resumida do KCCQ desde o início até após 5 semanas, 2, 4, 6 e 10 meses de acompanhamento. Serão apresentados gráficos exibindo a pontuação média estimada ajustada do KCCQ e os limites de confiança ao longo do tempo da regressão de splines cúbicas restritas. Calcularemos as alterações medianas na pontuação resumida do KCCQ, classe NYHA, distância no teste de caminhada de 6 minutos, BNP e FEVE desde o início até após 5 semanas, 2, 4, 6 e 10 meses de acompanhamento. O tempo até a morte ou perda de acompanhamento será estimado usando métodos de Kaplan-Meier. Todas as estimativas serão relatadas usando intervalos de confiança de 95% e um valor p ≤0,05 será considerado estatisticamente significativo.

Gerenciamento de dados Todos os dados serão gerenciados usando o mesmo sistema de coleta de dados (RedCap). Os dados serão armazenados no servidor RedCap do Ifakara Health Institute, em computador com dupla proteção por senha. A extração de dados é feita diariamente e armazenada em um serviço seguro de armazenamento em nuvem (IHI-drive e switchdrive para backup (https://drive.switch.ch) acessível apenas pelos membros da equipe de estudo por meio de autenticação de nome de usuário e senha. Assim, os dados podem ser tratados com segurança durante o projeto. Todas as estruturas de pastas e convenções de nomenclatura serão geradas pelos investigadores responsáveis, e todos os membros do projeto serão instruídos sobre como preencher os dados pelos investigadores responsáveis.

Segurança de dados O padrão de segurança será adotado a partir da ISO 27001 – Gestão de segurança da informação. Todos os dados dos participantes serão anonimizados e todos os dados serão protegidos por senha. Assim, a segurança dos dados será alta. Todos os dados relacionados ao estudo serão armazenados no servidor IHI de acordo com o protocolo da instituição.

Autorização Ética O protocolo será submetido à Ethikkomission der Nord-und Zentralschweiz, Suíça, ao Conselho de Revisão Institucional do Ifakara Health Institute e ao Comitê de Ética do Instituto Nacional de Pesquisa Médica da Tanzânia (NIMR). Os pacientes só serão incluídos se concordarem e após terem assinado o consentimento informado por escrito.

Riscos Sacubitril/Vasartan foi estudado em grandes ensaios clínicos randomizados e foi aprovado pelas administrações de alimentos e medicamentos e registrado em todo o mundo. Na Tanzânia, o Sacubitril/Valsartan é prescrito e registrado sob o nome Uperio®. Não esperamos mais efeitos colaterais do que os já descritos em ensaios anteriores. Como cerca de 5.000 pacientes são atendidos na clínica cardíaca e pulmonar por ano, e precisamos incluir 3 participantes por semana, não achamos que teremos problemas para recrutar todos os 238 participantes dentro do período do estudo. No entanto, outra pandemia poderá abrandar ou interromper o recrutamento.

Importância do estudo Apesar de o ARNI ter demonstrado ser benéfico para pacientes com ICFEr em estudos anteriores, nenhum africano, exceto algumas pessoas que vivem na África do Sul, foram incluídos nestes estudos. Antes de implementar o ARNI na África Subsaariana, são necessários dados sobre a eficácia e segurança do ARNI na população africana. Este estudo intervencionista pré-pós fornecerá essas informações, incentivando as partes interessadas e os médicos a implementar e prescrever este medicamento no futuro.

Período de estudo, cronograma e marcos

Período de estudo 30 meses, incluindo 10 meses de acompanhamento:

1º de março de 2025 a 30 de junho de 2027. A Figura 2 mostra a linha do tempo:

Figura 2: Linha do Tempo

Marcos Período de preparação: julho de 2024 a fevereiro de 2025 Primeiro paciente inscrito: 1º de março de 2025 Último paciente inscrito: 31 de agosto de 2026 Última consulta de acompanhamento: 30 de junho de 2027

Política de Publicação e Divulgação Pretende-se publicar os resultados deste estudo em uma revista com revisão por pares, de acordo com os regulamentos específicos da revista. Potenciais conflitos de interesse serão listados. A autoria das publicações será baseada nos padrões aceitos, conforme contido na diretriz "Requisitos Uniformes para Manuscritos Submetidos a Revistas Biomédicas do Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas" (http://www.icmje.org/urm_main.html). Cada pessoa designada como autor terá contribuído substancialmente para o conteúdo intelectual (concepção e desenho do estudo; aquisição, análise e interpretação dos dados) e para o manuscrito ou revisão, incluindo a aprovação final da versão a ser publicada. Para divulgar os resultados, os dados serão apresentados em conferências científicas nacionais, como a MUHAS, e em conferências nacionais sobre doenças não transmissíveis. Após a análise dos dados, as autoridades de saúde distritais, regionais e nacionais receberão uma carta com todos os resultados. Se solicitado, apresentaremos os resultados pessoalmente às autoridades de saúde.

Justificativa orçamentária Orçamento total proposto 247.064 CHF, 137.236 CHF seriam usados ​​para salários, 54.240 CHF para consumíveis e 22.450 CHF para custos diversos. O orçamento foi aprovado pelos escritórios de subvenções do Ifakara Health Institute e do Swiss TPH. O financiamento será fornecido pela Novartis East Africa.

Os custos dos medicamentos básicos para insuficiência cardíaca orientados pelas diretrizes serão cobertos pelos participantes ou pelo seu seguro de saúde. Sacubitril/valsartan duas vezes ao dia será fornecido pela Novartis durante o período do estudo (um total de 6.664 comprimidos de Uperio 50 mg, 9.996 comprimidos de Uperio 100 mg e 128.520 comprimidos de Uperio 200 mg). A Tabela 1 mostra o orçamento detalhado

Tabela 1: Orçamento Detalhado

Alocação orçamentária

Hospital Regional de Referência IHI St Francis Swiss TPH

Referências

1. Organização WH. Doenças Não Transmissíveis; https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/noncommunicable-diseases. 2023.
2. Dokainish H, Teo K, Zhu J, Roy A, AlHabib KF, ElSayed A, et al. Variações globais de mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca: resultados do estudo de coorte prospectivo International Congestive Heart Failure (INTER-CHF). Lanceta Glob Saúde. 2017;5(7):e665-e72.
3. Agbor VN, Essouma M, Ntusi NAB, Nyaga UF, Bigna JJ, Noubiap JJ. Insuficiência cardíaca na África Subsaariana: Uma revisão sistemática contemporânea e meta-análise. Int J Cardiol. 2018;257:207-15.
4. Raphael DM, Roos L, Myovela V, McHomvu E, Namamba J, Kilindimo S, et al. Doenças cardíacas e ecocardiografia na Tanzânia rural: Ocorrência, características e etiologias de patologias cardíacas subestimadas. PLoS Um. 2018;13(12):e0208931.
5. McDonagh TA, Metra M, Adamo M, Gardner RS, Baumbach A, Bohm M, et al. Diretrizes ESC 2021 para o diagnóstico e tratamento da insuficiência cardíaca aguda e crônica. Eur Heart J. 2021;42(36):3599-726.
6. Mebazaa A, Davison B, Chioncel O, Cohen-Solal A, Diaz R, Filippatos G, et al. Segurança, tolerabilidade e eficácia da titulação de terapias médicas orientadas por diretrizes para insuficiência cardíaca aguda (STRONG-HF): um ensaio multinacional, aberto e randomizado. Lanceta. 2022;400(10367):1938-52.
7. McDonagh TA, Metra M, Adamo M, Gardner RS, Baumbach A, Bohm M, et al. Atualização focada em 2023 das Diretrizes da ESC de 2021 para o diagnóstico e tratamento da insuficiência cardíaca aguda e crônica. Eur Heart J. 2023;44(37):3627-39.
8. McMurray JJ, Packer M, Desai AS, Gong J, Lefkowitz MP, Rizkala AR, et al. Inibição da angiotensina-neprilisina versus enalapril na insuficiência cardíaca. N Engl J Med. 2014;371(11):993-1004.
9. Verde CP, Porter CB, Bresnahan DR, Spertus JA. Desenvolvimento e avaliação do Questionário de Cardiomiopatia de Kansas City: uma nova medida do estado de saúde para insuficiência cardíaca. J Sou Coll Cardiol. 2000;35(5):1245-55.
10. Thomas M, Khariton Y, Fonarow GC, Arnold SV, Hill L, Nassif ME, et al. Associação entre início de sacubitril/valsartana e trajetórias do estado de saúde no mundo real ao longo de 18 meses em insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida. ESC Insuficiência Cardíaca. 2021;8(4):2670-8.
11. Velázquez EJ, Morrow DA, DeVore AD, Duffy CI, Ambrosy AP, McCague K, et al. Inibição da Angiotensina-Neprilisina na Insuficiência Cardíaca Descompensada Aguda. N Engl J Med. 2019;380(6):539-48.
12. Ibrahim NE, Pina IL, Camacho A, Bapat D, Felker GM, Maisel AS, et al. Diferenças raciais e étnicas em biomarcadores, estado de saúde e remodelação cardíaca em pacientes com insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida tratados com sacubitril/valsartan. Circ insuficiência cardíaca. 2020.
13. Wang TD, Tan RS, Lee HY, Ihm SH, Rhee MY, Tomlinson B, et al. Efeitos do Sacubitril/Valsartan (LCZ696) na Natriurese, Diurese, Pressão Arterial e NT-proBNP na Hipertensão Sensível ao Sal. Hipertensão. 2017;69(1):32-41.
14. Seferovic JP, Claggett B, Seidelmann SB, Seely EW, Packer M, Zile MR, et al. Efeito do sacubitril/valsartana versus enalapril no controle glicêmico em pacientes com insuficiência cardíaca e diabetes: uma análise post-hoc do estudo PARADIGM-HF. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(5):333-40.
15. Haynes R, Juiz PK, Staplin N, Herrington WG, Storey BC, Bethel A, et al. Efeitos do Sacubitril/Valsartan versus Irbesartan em pacientes com doença renal crônica. Circulação. 2018;138(15):1505-14.
16. Mancia G, Kreutz R, Brunstrom M, Burnier M, Grassi G, Januszewicz A, et al. Diretrizes ESH de 2023 para o tratamento da hipertensão arterial O Grupo de Trabalho para o tratamento da hipertensão arterial da Sociedade Europeia de Hipertensão: Aprovado pela Sociedade Internacional de Hipertensão (ISH) e pela Associação Renal Europeia (ERA). J Hipertensos. 2023;41(12):1874-2071.
17. Senni M, McMurray JJ, Wachter R, McIntyre HF, Reyes A, Majercak I, et al. Iniciando sacubitril/valsartan (LCZ696) na insuficiência cardíaca: resultados de TITRATION, uma comparação duplo-cega e randomizada de dois regimes de titulação. Eur J insuficiência cardíaca. 2016;18(9):1193-202.