Влияние мезенхимальных стромальных клеток на сепсис и септический шок

Дизайн и условия исследования Исследование проводилось в отделении интенсивной терапии внутренних болезней (IMICU) и отделении интенсивной терапии анестезиологии и реанимации (ARICU) университетской больницы Эрджиес, которая является специализированной больницей в Центральной Анатолии. Исследование было одобрено Советом по этике Университета Эрджиес (2016/114; Дата: 19.02.2016) и Министерством здравоохранения Турции. Информированное согласие от лиц, принимающих решения, было получено для участия в исследовании после подтверждения критериев приемлемости.

Пациенты. Исследование планировалось как проспективное. В течение двух лет в исследование было включено 10 пациентов с сепсисом и септическим шоком из IMICU и ARICU. Сепсис и септический шок диагностировали в соответствии с рекомендациями по сепсису [1]. Критериями включения в это исследование были; пациенты в возрасте от 18 до 80 лет, госпитализированные в ИМИТН и ОРИТН с диагнозом сепсис и септический шок. Критерии исключения были разделены на категории: пациенты моложе 18 лет и старше 80 лет, беременные женщины или кормящие грудью; пациенты с терминальной стадией рака, прогрессирующим заболеванием легких, получающие кислород в домашних условиях, прогрессирующей легочной гипертензией (класс III или IV по ВОЗ), прогрессирующей сердечной недостаточностью (класс III или IV по Американской кардиологической ассоциации), тяжелым заболеванием печени (класс C по ребенку) и анамнезом анафилаксии. Всем больным проводилась стандартная терапия сепсиса, предложенная в рекомендациях [1,2], а больным основной группы дополнительно применялась терапия МСК. Пациенты контрольной группы с диагнозом сепсис и септический шок и имеющие сходные характеристики для рассмотрения тяжести заболевания на основании оценки APACHE II и сопутствующих заболеваний с исследуемой группой были отобраны из записей IMICU и ARICU ретроспективно.

Регистрировались демографические характеристики пациентов, основные заболевания, клинические и лабораторные результаты.

Источник и применение МСК МСК были получены в лаборатории надлежащей производственной практики (GMP) Центра генома и стволовых клеток Университета Эрджиес. Процедуры оценки производства клеток и контроля качества проводились в соответствии с протоколами GMP, утвержденными Министерством здравоохранения Турции. Аллогенные МСК жирового происхождения (АДМСК), полученные от здорового донора, применяли всем пациентам исследуемой группы. Пациентам вводили по пять доз АДМСК на 1-й и 3-й день (после размораживания криопакета с замороженными МСК), 5-7-й и 9-й день (пересеянные флаконы с АДМСК) терапии. Каждая доза ADMSC была приготовлена ​​как 1×106 ADMSC/кг. Флаконы, содержащие ADMSC, перед использованием перемешивали нежными движениями; таким образом, обеспечивается гомогенизация продукта. АДМСК вводили внутривенно через центральную венозную магистраль в физиологическом растворе с использованием набора для переливания крови. Во время всех этих процедур пациенты находились под наблюдением.

Приготовление ADMSC Достаточное количество флаконов с криоконсервированными ADMSC оттаивали, чтобы обеспечить необходимую дозу для введения. Замороженные ADMSC оттаивали и культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10 % сыворотки человека, 1 % раствора пенициллина-стрептомицина и 1 % стабильного глутамина (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Израиль) при 37°C и 5°C. % CO2-инкубатор, описанный ранее [16]. Вкратце, ADMSC извлекали, ресуспендировали в физиологическом растворе и переносили пациенту с терморегулируемым мешком. Помимо выявления фенотипических характеристик клеток и микробиологических тестов оценивали морфологию внешнего вида и жизнеспособность клеток. Иммунофенотипическую характеристику АДМСК проводили с помощью анализов проточной цитометрии (Beckman Coulter, США) с антителами против CD45, CD73, CD90, CD105, CD11b, CD19, CD34, CD44 (комплект BD Stem Flow hMSC).

Цитокиновый анализ 10 мл образцов периферической венозной крови собирали перед каждой инфузией МСК на 1-й, 3-й, 5-й, 7-й и 9-й день терапии. Образцы сыворотки центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут и хранили при -80°С до лабораторного анализа. Уровень цитокинов анализировали методом ELISA с использованием наборов Human BioSource for (TNF-, IFN-γ, IL-2, IL-4 и IL-10) на устройстве Robonik Read Well Touch model (Robonik India Pvt Ltd).

Клинико-лабораторное наблюдение Клинические данные и результаты лабораторных исследований регистрировали при введении инфузий МСК на 1-й, 3-й, 5-й, 7-й и 9-й дни. Регистрировались демографические характеристики пациентов, основные заболевания, клинические и лабораторные результаты. Пациенты находились под наблюдением на предмет неожиданных нежелательных явлений. При клиническом наблюдении за пациентами регистрировались баллы по шкале APACHE II, SOFA (последовательная оценка органной недостаточности), клиническое прогрессирование и исход заболевания. В качестве лабораторных показателей маркеры воспаления; Регистрировались также С-реактивный белок (СРБ), прокальцитонин (ПКТ) и лейкоциты (лейкоциты), параметры кровотечения (тромбоциты, МНО, фибриноген), лактат, ферменты печени (АСТ, АЛТ), функции почек (креатинин). Результаты лабораторных исследований анализировали по дням введения МСК. Различия лабораторных тестов сравнивали между выжившими и невыжившими пациентами в зависимости от количества дней терапии МСК.

Исходы пациентов сравнивали с предыдущим обсервационным исследованием, проведенным в тех же отделениях интенсивной терапии (ОИТ), что и контрольная группа. День смерти и 0–6-й, 7–14-й и 15–28-й дни определяли как статус выживания и конечную точку. В случае смерти также фиксировались дата и причина смерти.

Статистический анализ. В исследовании результаты сравнивали с контролем. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Turcosa. Отношения между категориальными переменными были проанализированы с помощью анализа хи-квадрат. Когда для сравнения числовых переменных в двух группах были предоставлены параметрические предположения, использовался критерий Стьюдента-Т, а U-критерий Манна-Уитни применялся в случае, когда параметрические предположения не обеспечивали. Для анализа повторных измерений; Для бинарных сравнений использовали Т-тест для парных образцов, а для сравнения более двух повторных измерений использовали тест ANOVA с повторными измерениями. Вероятность выживания пациентов в течение периода наблюдения определяли с помощью анализа выживаемости Каплана-Майера. Влияние возраста и APACHE II на анализ ковариантов было скорректировано. р<0,05 принимали за статистически значимые.