Efecto de las células estromales mesenquimales sobre la sepsis y el shock séptico

Diseño y entorno del estudio El estudio se llevó a cabo en la Unidad de Cuidados Intensivos de Medicina Interna (IMICU) y la Unidad de Cuidados Intensivos de Anestesiología y Reanimación (ARICU) del Hospital Universitario Erciyes, que es un hospital de referencia en Anatolia Central. El estudio fue aprobado por el Consejo de Ética de la Universidad de Erciyes (2016/114; Fecha: 19.02.2016) y el Ministerio de Salud de Turquía. Se tomó el consentimiento informado de los tomadores de decisiones sustitutos para la participación en el estudio después de la confirmación de los criterios de elegibilidad.

Pacientes El estudio se planeó de forma prospectiva. Durante dos años, se incluyeron en el estudio 10 pacientes con sepsis y shock séptico de IMICU y ARICU. La sepsis y el shock séptico se diagnosticaron de acuerdo con las guías de sepsis [1]. Los criterios de inclusión para este estudio fueron; pacientes que tenían entre 18-80 años de edad y estaban hospitalizados en IMICU y ARICU con el diagnóstico de sepsis y shock séptico. Los criterios de exclusión se clasificaron en pacientes menores de 18 años y mayores de 80 años y mujeres embarazadas o en período de lactancia; pacientes que tenían cáncer en etapa terminal, enfermedad pulmonar avanzada que recibía oxígeno en el hogar, hipertensión pulmonar avanzada (clase III o IV de la OMS), insuficiencia cardíaca avanzada (clase III o IV de la American Heart Association), enfermedad hepática grave (Niño C) y antecedentes de anafilaxia. Se administró a todos los pacientes el tratamiento estándar para la sepsis, tal como se sugiere en las directrices [1,2] y, además, se aplicó el tratamiento de MSC a los pacientes del grupo de estudio. Los pacientes de control con diagnóstico de sepsis y shock séptico y que tenían características similares para la consideración de la gravedad de la enfermedad según la puntuación APACHE II y las enfermedades comórbidas con el grupo de estudio se seleccionaron retrospectivamente de los registros de IMICU y ARICU.

Se registraron las características demográficas de los pacientes, las enfermedades subyacentes y los resultados clínicos y de laboratorio.

Origen y aplicación de las MSC Las MSC se prepararon en el Laboratorio de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) del Centro de Genoma y Células Madre de la Universidad de Erciyes. Los procedimientos de evaluación de la producción celular y el control de calidad se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos GMP autorizados por el Ministerio de Salud de Turquía. Se aplicaron MSC alogénicas derivadas de tejido adiposo (ADMSC) que se obtuvieron de un donante sano a todos los pacientes del grupo de estudio. Se aplicaron cinco dosis de ADMSC a los pacientes en los días 1 y 3 (después de la descongelación de la bolsa criogénica de MSC congelada), en los días 5, 7 y 9 (viales de ADMSC replaqueados) de terapia. Cada dosis de ADMSC se preparó como 1 x 106 ADMSC/kg. Los viales que contenían ADMSC se mezclaron con movimientos suaves antes del uso; así, aseguró la homogeneización del producto. Las ADMSC se infundieron por vía intravenosa a través de una línea venosa central en una solución salina fisiológica mediante el uso de un equipo de transfusión de sangre. Los pacientes fueron monitoreados durante todos estos procedimientos.

Preparación de ADMSC Se descongelaron suficientes viales de ADMSC crioconservadas para proporcionar la dosis necesaria para la administración. Las ADMSC congeladas se descongelaron y cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero humano al 10 %, solución de penicilina-estreptomicina al 1 % y glutamina estable al 1 % (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) a 37 °C y 5 % de incubadora de CO2 que se describió antes [16]. Brevemente, las ADMSC se recuperaron y se resuspendieron en solución salina fisiológica y se transfirieron al paciente con la bolsa de temperatura controlada. Se evaluó la morfología del aspecto celular y la viabilidad además de la identificación de características fenotípicas de las células y pruebas microbiológicas. La caracterización inmunofenotipada de las ADMSC se realizó mediante análisis de citometría de flujo (Beckman Coulter, EE. UU.) con anticuerpos contra CD45, CD73, CD90, CD105, CD11b, CD19, CD34, CD44 (kit BD Stem Flow hMSC).

Análisis de citocinas Se recogieron diez ml de muestras de sangre venosa periférica antes de cada infusión de MSC en los días 1, 3, 5, 7 y 9 de la terapia. Las muestras de suero se centrifugaron a 5000 rpm durante 5 minutos y se almacenaron a -80°C hasta su análisis en laboratorio. El nivel de citocinas se analizó con el método ELISA utilizando kits Human BioSource para (TNF-, IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10) en el dispositivo modelo Robonik Read Well Touch (Robonik India Pvt Ltd).

Seguimiento clínico y de laboratorio Los hallazgos clínicos y los resultados de laboratorio se registraron en la administración de las infusiones de MSC en los días 1, 3, 5, 7 y 9. Se registraron las características demográficas de los pacientes, las enfermedades subyacentes y los resultados clínicos y de laboratorio. Los pacientes fueron monitoreados por eventos adversos inesperados. En el seguimiento clínico de los pacientes se registraron la puntuación APACHE II, SOFA (puntuación secuencial de evaluación de la insuficiencia orgánica), la progresión clínica y la evolución de los pacientes. Como seguimiento de laboratorio, marcadores inflamatorios; También se registró proteína C reactiva (PCR), procalcitonina (PCT) y glóbulos blancos (WBC), parámetros de sangrado (plaquetas, INR, fibrinógeno), lactato, enzimas hepáticas (AST, ALT), funciones renales (creatinina). Los resultados de las pruebas de laboratorio se analizaron según los días de administración de las MSC. Se compararon las diferencias de las pruebas de laboratorio entre los pacientes sobrevivientes y no sobrevivientes según los días de terapia de MSC.

Los resultados de los pacientes se compararon con el estudio observacional anterior realizado en las mismas Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) como control. El día de la muerte y los días 0-6, 7-14 y 15-28 se determinaron como estado de supervivencia y criterio de valoración. En caso de muerte, también se registró la fecha y la causa de la muerte.

Análisis estadístico En el estudio, los resultados se compararon con los controles. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Turcosa. Las relaciones entre las variables categóricas se analizaron mediante el análisis de chi-cuadrado. Cuando se proporcionaron supuestos paramétricos en comparación de variables numéricas en dos grupos, se utilizó la prueba T de Student y la prueba U de Mann Whitney en el caso de que no se proporcionaran los supuestos paramétricos. Para el análisis de mediciones repetidas; Se usó la prueba T de muestras pareadas para las comparaciones binarias y la prueba ANOVA de medidas repetidas se usó para la comparación de más de dos medidas repetidas. La probabilidad de supervivencia de los pacientes durante el período de seguimiento se determinó mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Maier. Se ajustó el efecto de la edad y APACHE II al análisis de covariantes. p <0,05 fue aceptado como estadísticamente significativo.