För att upptäcka kryoimmunologisk respons inducerad av tidig bröstcancer Ultraljudsvägledd kryoablation (ICE-studie)

Vi kommer att registrera kvinnor med en biopsibeprövad diagnos av bröstcancer i tidigt stadium (T1 N0), som inte är berättigade till neo-adjuvant terapi, planerad till bröstoperation (mastektomi eller nodulektomi), som har gett informerat samtycke till studien.

Vi kommer att rekrytera 30 kvinnor som ska genomgå kryoablation. Deras resultat kommer att jämföras med de som erhållits från en kontrollgrupp på 30 kvinnor, som kommer att följa samma terapeutiska väg för behandling av bröstcancer utan att utföra kryoablation.

Det primära syftet med vår studie är karakteriseringen av den immunogena celldöden (ICD) inducerad, det inflammatoriska svaret och moduleringen av cirkulerande T-immunceller inducerad av tumörkryoablationsbehandling i serum från bröstcancerpatienter.

De cirkulerande ICD-biomarkörerna HMGB1, calreticulin och HSP70/90 kommer att analyseras och även profilen för cytokiner av Th1- och Th2-typ (IFN-y, IL-12 (p40/p70), IL-15, IL-17, IL-2, IL-7, IP-10, IL-13, IL-5, IL-4), pro-inflammatoriska cytokiner (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-1RA, IL-2R, IL-8, CRP, IL-17, IFN-α), immunsuppressiva cytokiner (TGF-β1, IL-10, PGE2), kemokiner (CCL5/RANTES, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL2/MCP -1, CXCL9/MIG, CCL11/Eotaxin). Immuncellsundergrupper kommer att karakteriseras av flödescytometri: förutom de konventionella immuncellsundergrupperna (NK, Monocyte, Granulocyte, T- och B-celler), kommer specifika T-cellsundergrupper (Treg, naiv, minne, central effektor) att karakteriseras och även uttrycket av immunmarkörer associerade med aktivering (CD137) eller suppression/utmattning (PD1, CTLA4, TIM3, LAG3).

Sekundära slutpunkter är:

1. Kryoablationsbehandlingens effektivitet och säkerhet

   Vi kommer att utvärdera Recist-kriteriernas frekvens av fullständigt svar på kryoablation med bröstultraljud och bröst-MR. Incidensen och svårighetsgraden av komplikationer relaterade till kryoablation kommer att övervakas för att fastställa säkerhetsprofilen för att ta bort bröstcancer med 10 mm marginaler runt den primära tumören.

2. Kryoablationsbehandlingsförmåga för att inducera immunogen tumörcelldöd.

   Närvaron och omfattningen av tumörnekros/apoptos på kirurgiska provsektioner färgade med hematoxylin-eosin kommer att utvärderas. Immunhistokemiska tester kommer att användas för att verifiera aktiveringen av apoptotiska mekanismer och immunogen celldödsaktivering.

3. Tumörmikrovesiklar frigörs efter kryoablationsbehandling. Under celldöd transporterar mikrovesiklar (MV) som frigörs av cellen en komplex molekylär last som kan fungera som en källa till antigenrepertoar och aktiverande signaler till antigenpresenterande celler (APC). Tumörhärledda MV:er frisatta i patienternas serum kommer att isoleras genom ultracentrifugeringssteg såsom beskrivits tidigare. De isolerade MVs kommer att testas för uttryck av Calreticulin och HMGB1.

Alla inskrivna patienter kommer att genomgå serier av kontroller enligt nedan (ICE-STUDY STEG):

inskrivningskontroll (STEG 0), bröst-MRT pre-kryoablationsbehandling (STEG 1) och post-kryoablationsbehandling (STEG 4), bröstcancer USA-guided kryoablation

(STEG 2), blodprov för att bedöma immunsvar (STEG 1, STEG 3, STEG 4, KIRURGI och STEG 5) och immunhistopatologisk analys av kirurgiskt prov.

Inskrivningskontroll (STEG 0) kommer att utföras av en radiolog och en onkolog, där patientens sjukdomshistoria samlas in och en bröstundersökning av det drabbade stället kommer att utföras. Patienten kommer också att genomgå bröst-UL för att utvärdera möjligheten till kryoablationsbehandling (avstånd >1 cm mellan tumören och huden, bröstvårtan eller bröstväggen). Om patienten anses vara berättigad till studien kommer protokollet att illustreras i detalj och informerat samtycke kommer att samlas in.

Bröst-MR kommer att utföras före kryoablation (STEG 1) och efter kryoablation (STEG 4) för att bedöma framgångshastigheten för Visual-ICE-ablation. Algoritmer för artificiell intelligens kommer också att användas för detta ändamål. Effektiviteten av kryoablationsbehandling kommer också att utvärderas med ultraljud (STEG 4).

STEG 2 består av USA-styrd kryoablationsbehandling av bröstskadan.

Inom 21 dagar från inskrivningen kommer patienten att genomgå bröstoperation och blodprov.

Under det sista steget kommer patienten att genomgå klinisk bröstundersökning, blodprov för att bedöma immunsvar och frågeformulär om patientnöjdhet.

IS-STUDIESTEG:

STEG 0: inskrivningskontroll

• Bildbehandling: USA

• Bedömning:

  1. samtycke
  2. bröstbiopsi med histologiskt resultat
  3. klinisk historia
  4. laboratorieresultat
  5. klinisk bröstundersökning
  6. farmakologisk terapi

STEG 1: Inom 10 dagar från STEG 0

• Avbildning: MRT (pre-kryoablationsbehandling)

• Bedömning:

  1. blodprov för immunsvar

  2. bieffekter

     STEG 2: KRYOABLATION (minst 24 timmar efter MRT)

• Bedömning:

  1. kryoablationskomplikationer och biverkningar

     STEG 3: Blodprov för immunsvar (48/72 timmar efter kryoablation)

STEG 4: Efter 7 dagar från kryoablation och före operation

• Avbildning: MRT och/eller UL (behandling efter kryoablation)

• Bedömning:

  1. frågeformulär om patientnöjdhet.
  2. Bieffekter
  3. farmakologisk terapi
  4. klinisk bröstundersökning
  5. blodprov för immunsvar

KIRURGI: Inom 21 dagar från STEG 0

• Bedömning:

  1. kirurgi
  2. komplikationer
  3. prov histologisk utvärdering

  4. blodprov för immunsvar

     STEG 5 - SLUT: Minst 10 dagar efter operationen

• Bedömning:

  1. frågeformulär om patientnöjdhet
  2. bieffekter
  3. farmakologisk terapi
  4. klinisk bröstundersökning
  5. blodprov för immunsvar

Alla kryoablationssessioner kommer att utföras under amerikansk vägledning av en enda styrelsecertifierad interventionsradiolog. Biopsi, perkutan kryoablation kommer att utföras med en argonbaserad kryoablationsenhet (BTG Cryoablation System).

Både preoperativa UL- och MR-bilder kommer att jämföras för att fastställa den korrekta placeringen av sonden för tumörablation. Alla procedurer kommer att utföras under lokalbedövning som ges genom injektion av 2-5 ml 2% lidokain proximalt till tumörskadan och längs med kryosonderna. En eller flera kryoprober kommer att sättas in i den riktade tumören med hjälp av amerikansk vägledning, genom ett litet hudsnitt på 1-2 mm. För att undvika kryoinducerad hudskada och underlätta ablationen av bröstvävnad minst 1 cm bortom alla uppenbara tumörmarginaler, kommer värmepåsar att placeras på bröstets hud.

På grund av den relativt låga värmebelastningen av bröstparenkym jämfört med inre organ, uppskattades det att 1 cm synlig is bortom alla tumörmarginaler skulle behövas för att generera cytotoxiska temperaturer (t.ex. -40¿C) genom hela brösttumören.

Varje kryoablationsbehandling består av två cykler på 8 minuter, följt av en 4 minuters aktiv upptiningsfas och en 4 minuters passiv upptiningsfas. Det senare anses användbart för att maximera celldöd. USA:s vägledning kommer också att användas för att verifiera bildandet av ett homogent hypoechoiskt område, på grund av isbollen, som omfattade tumören runt om och för att upptäcka tidiga komplikationer. Sonderna kommer att tas bort efter den andra fasen av upptining, utan behov av hudsutur. Efter ingreppet kommer patienterna att skrivas ut 2 timmar efter ablationen utan recept.

Det kliniska resultatet kommer att utvärderas med UL i slutet av kryoablationsproceduren och 7 dagar efter med klinisk undersökning och MRT. Frånvaron av sådana tecken eller symtom kommer att tolkas som ett optimalt kliniskt resultat.

Immunogen celldöd och inflammatoriska cirkulerande biomarkörer kommer att analyseras vid olika tidpunkter (5 tidpunkter:

före, 48 timmar och 7 dagar efter kryoablation; före och efter 10 dagar efter operationen). Plasma kommer att isoleras med EDTA-behandlat blod (10 ml/prov) genom centrifugering (4000 rmp/5'/4°C) och alikvoteras och förvaras vid -80°C.

ICD-biomarkörerna som karakteriseras kommer att vara: calreticulin, HMGB1, HSP70/90 (genom ELISA och/eller kemiluminescensimmunsandwichtester).

Cirkulerande inflammatoriska mediatorer kommer också att analyseras av xMAP Multiplex-plattformen inklusive följande molekyler:

Cytokiner av Th1- och Th2-typ (IFN-y, IL-12 (p40/p70), IL-15, IL-17, IL-2, IL-7, IP-10, IL-13, IL-5, IL-4 ), pro-inflammatorisk

cytokiner (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-1RA, IL-2R, IL-8, CRP, IL-17, IFN-α), immunsuppressiva cytokiner (TGF-β1, IL- 10, PGE2), kommer kemokiner (CCL5/RANTES, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL2/MCP-1, CXCL9/MIG, CCL11/Eotaxin)] att analyseras.

Proverna från varje patient kommer att analyseras för varje biomarkör samtidigt för att undvika fördomar mellan experiment.

Mikrovesiklar kommer att isoleras genom ultracentrifugeringssteg i mikrometodskala (2 mL plasma) och analysen av calreticulin och HMGB1 kommer att utföras med flödescytometri/ELISA (3 Tidpunkt: före, 48h och i slutet av proceduren) Immun fenotypning kommer att utföras genom multiparametrisk flödescytometri, som karakteriserar immuncellsundergrupperna (NK, T, B-celler, granulocyter, monocyter). T-cellsundergrupper kommer att karakteriseras specifikt för Treg (CD25/foxp3), Naiv/minneseffektorminne T-cell (CCR7/CD45RA) och för aktiverande eller utmattad fenotyp (CD137, ICOS, PD1, CTLA4, TIM3, LAG3).