促红细胞生成素治疗蛛网膜下腔出血

背景：

1. 蛛网膜下腔出血的迟发性缺血缺陷

   在英国，每年有 7000 名患者患有 SAH，年轻人（<55 岁）同样受到影响。 脑血管痉挛和相关的脑缺血是在最初的 SAH 事件中幸存下来的患者延迟发病和死亡的主要原因。 先前的研究表明，SAH 伴随即刻低脑血流量 (CBF)，特别是在昏迷患者中。 然而，对于等级较高的患者，低 CBF 通常会延迟出现并与脑血管痉挛相关 [Knuckey 1985]。 血管痉挛通常先于 DID 发作，后者通常发生在 SAH 后第 2 周 [Knuckey 1985]。 自动调节是最完善的反射机制，反映了脑血管扩张的内在能力，试图在脑灌注不良的情况下维持恒定的 CBF。 SAH 后，自动调节功能受损会影响预后 [Lam 2000]。 事实上，自动调节的每日评估可以帮助识别临床恶化高风险的患者 [Smielewski 1997]。

   可以使用经颅多普勒 (TCD) 在床边方便地无创地测量自动调节。 直接测量大脑中动脉血流速度 (FV) 可预测 DID；升高的平均 FV（>120cms/sec）和 MCA 与颅外颈内动脉 (ICA) 之间的 mFV 比率增加（Lindegaard 比率 >3）与脑血管痉挛和更高的不良事件发生率有关 [Lindegaard 1988]。 FV 随时间的快速增加也是预测性的，FV 与血压自发变化之间的关系（相关指数 Mx）也是如此 [Czosnyka 2000]。

   异常脑血管血液动力学的一种更复杂的测量方法涉及瞬时充血反应试验 (THRT) [Giller 1991]。 这是我们部门的常规使用，我们已经证明异常 THRT 与 SAH 后的临床结果之间存在关系 [Lam 2000]。 THRT 评估 FV 对手动颈动脉压缩的反应（图 1），并且可以在几分钟内重复，为评估自动调节提供了一种可靠且易于访问的方法。 当 THRT 用于同一患者的日常评估时，该测试可以提供有价值的自动调节顺序变化监测。

2. SAH 后的自动调节

   SAH 后自动调节通常受损，即使是临床分级良好的患者 [Voldby 1985]。 异常的 THRT 反应通常在初始出血后的第 0 至 3 天早期（主要）或第 7 至 14 天左右（次要）晚期出现。 THRT 的原发性异常在分级较差的患者中更为常见，而继发性异常更常见于最初分级良好的患者，这些患者后来出现 DID 迹象并伴有临床恶化 [Ratsep 2002]。 使用 TCD 进行自动调节的常规和日常评估有助于识别 DID 风险较高的患者。 这种在较高级别患者中异常自动调节反应演变的延迟提供了引入旨在抵消潜在有害影响的早期治疗策略的机会。 事实上，考虑到这一目标，血浆扩增的常规使用已经被采用 [Origitano 1990]。

3. 治疗机会；为什么要重组人促红细胞生成素？

最近，注意力集中在具有神经保护特性的内源性脑蛋白的潜在治疗作用上。 这种使用促红细胞生成素 (EPO) 的神经保护方法旨在保护可能存活的脑组织免于细胞凋亡 [Ehrenreich 2002]。 EPO 是一种 34-kDa 疏水性唾液酸糖蛋白，负责定型红系祖细胞的存活、增殖和分化。 它由胎儿肝脏和成人肾脏产生，在缺氧期间加速 [Lacombe 1999]。 由于没有预先形成的 EPO 储存，因此，EPO 基因转录的控制涉及与缺氧诱导因子 1 (HIF-1) 的复杂相互作用，HIF-1 是一种在缺氧、低血糖和癫痫发作期间被激活的转录因子 [Lacombe 1999] .

EPO 受体 (EPO-R) 与造血受体家族的其他成员一样，不具有内源性酪氨酸激酶活性。 然而，它与 Jak2 酪氨酸激酶的密切联系可以诱导许多蛋白质的快速酪氨酸磷酸化 [Lacombe 1999]。 缺氧会导致 EPO-R 表达增加，进而导致对 EPO 的敏感性增加 [Chin 2000]。

EPO 和 EPO-R 都普遍分布在神经组织中 [Digicaylioglu 1995]。 除了较大的血管外，EPO-R 大量分布在星形胶质细胞、神经元和脑毛细血管内皮细胞中 [Marti 1996，Yamaji 1996，Bernaudin 1999，Brines 2000]。 免疫组织化学表明，EPO-R 的这些分布与血脑屏障 (BBB) 的解剖位置一致 [Brines 2000]。 EPO-R 在大脑毛细血管内和周围的这种密集分布意味着少量的 EPO 足以调节中枢神经系统的生理功能 [Chin 2000]。 星形胶质细胞和神经元响应缺氧和贫血而增加的 EPO 产生与肾脏和肝脏中发生的情况相对应 [Masuda 1994]。 因此，在缺氧期间，EPO 通过星形胶质细胞的旁分泌机制和肾脏的内分泌机制，作为血管生成因子直接作用于脑毛细血管内皮细胞 [Digicaylioglu 1995]。

EPO 在任何以 ATP 相对缺乏为特征的条件下保护神经组织 [Brine 2000]。 这种神经保护作用是通过多种机制实现的。

1. EPO 可以诱导几种糖酵解酶的表达，从而将能量代谢重新导向有利于缺氧期间的生存 [Digicaylioglu 1995]。
2. 在脑缺血期间，N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受体介导的谷氨酸毒性是神经元死亡的主要原因 [Morishita 1997]。 谷氨酸毒性部分由一氧化氮 (NO) 介导。 EPO 在血管平滑肌细胞的转录水平上上调抗氧化酶的表达 [Kusano 1999]，并可能保护神经元免受 NO 生成剂的影响 [Sakanaka 1998]。 此外，EPO 可以抑制谷氨酸诱导的 Ca2+ 浓度增加和一氧化氮 (NO) 诱导的细胞凋亡 [Morishita 1997]。

EPO 已被证明具有神经营养作用 [Konishi 1993] 和血管生成作用 [Yamaji 1996]，并且它具有神经再生的潜力 [Siren 2001]。 这些影响是剂量依赖性的，与神经生长因子 (NGF) 无关 [Konoshi Y 1993]。 EPO和EPO-R的分布与脑缺血/梗死的组织病理学变化顺序相对应。 在急性缺氧（心脏骤停）中，可以在血管内皮中发现 EPO 的强免疫反应性，而 EPOR 在神经元中强烈表达 [Siren 2001]。 脑缺血后，EPO在血管生成和神经胶质反应中起重要作用。 EPO 免疫反应性出现在半暗带的内皮细胞、血管内炎症细胞和神经元中。 EPO-R 也在神经元、星形胶质细胞和内皮细胞中表达 [Bernaudin 1999, Siren 2001]。 因为 EPO-R 的表达先于 EPO 合成的上调 [Bernaudin 1999]，所以对 EPO 的敏感性增加 [Chin 2000]。 相比之下，这些变化在非缺血性皮层中检测不到 [Bernaudin 1999]，表明 EPO 在神经元处于危险中发挥作用的可能性增加 [Siren 2001]。 通过保护内皮细胞免于凋亡，EPO 可以增加脑血流量，改善半暗带的微循环，并通过血管生成改善组织氧合，从而显着减少梗塞体积 [Bernaudin 1999，Siren 2001]。 这种血管生成对应于以下发现：在低氧条件下（例如暴露于高海拔地区），大脑会增加平均微血管密度 [Lamanna JC 1992]。 在陈旧性梗塞中，EPO 和 EPO-R 在反应性星形胶质细胞中强烈表达。 因此 EPO 系统可能参与修复过程 [Siren 2001]。 中风后星形胶质细胞生成 EPO 的持续上调也提供了快速可用的 EPO 来源，使神经元更能耐受缺血 [Siren 2001]。 这些内源性神经保护机制不足以应对急性损伤，因为严重的缺血性损伤会耗尽大脑的 EPO/EPO-R 神经保护能力，或者从头合成的潜伏期太长。 EPO 的临床应用应迅速进行，以提供额外的神经保护作用 [Brines 2000]。

Epoetin beta 是一种采用重组 DNA 技术制造的 165 个氨基酸的糖蛋白，它含有与分离的人 EPO 相同的氨基酸序列，具有相同的生物活性。 它与内源性 EPO 相似，只是 4 条碳水化合物链的模式存在细微差异。 [Brine 2000] 重组人EPO已广泛用于治疗与慢性肾功能不全、HIV感染、癌症和手术相关的贫血，并在广泛的临床实践中具有良好的安全记录。

4. 为什么要使用 90,000 IU Epoetin beta？

epoetin beta 治疗人类急性中风（8 小时内）的安全性和有效性已在一项双盲、随机、安慰剂对照临床试验中得到证实，该试验使用高剂量静脉注射 epoetin beta（3,3000 IU/50 ml/ 30 分钟/天，三天，累积剂量 100,000IU) [Ehrenreich 2002]。 在该试验中未发现血压、血细胞比容、血红蛋白和红细胞计数的相关变化 [Ehrenreich 2002]。 在最后一剂 EPO 后的第 4 天，只有网织红细胞计数增加了 29.2 ±10.0% [Ehrenreich 2002]。 这种 EPO 的全身给药还导致 CSF 水平增加 60 到 100 倍，并且不需要破坏血脑屏障 (BBB) [Ehrenreich 2002]。 接受 EPO 治疗的患者血清 S100（由反应性星形胶质细胞分泌和脑细胞膜完整性的功能紊乱分泌）较低且较早激增，此后比安慰剂更快恢复到正常范围内 [Ehrenreich 2002]。 血清 S100 较早恢复到正常水平意味着炎症过程和/或 BBB 完整性可以通过全身 EPO 治疗更快地得到改善 [Ehrenreich 2002]。 对中风患者的有益影响会持续 30 天，特别是对于中度至重度中风患者 [Ehrenreich 2002]。

通过激活内皮 EPO 受体，循环的 EPO 可能会影响脑动脉中的炎症通路，并减轻 SAH 引起的血管痉挛。 体内研究发现，在 SAH 后立即全身给予 EPO（i.p. 1000units/kg）可以改善生存和运动功能 [Buemi 2000]。 EPO 的全身递送的优势在于它普遍适用于整个大脑的毛细血管内皮细胞，这与脑室内注射形成对比，脑室内注射高度局部化并且在临床环境中不实用 [Brines 2000]。 由于 CSF 中 EPO 的浓度与动脉瘤性 SAH 患者的血清水平和 BBB 破坏程度无关，因此 CSF 中的 EPO 主要由大脑产生以满足其需要 [Springborg 2003]。 因此，内皮 EPO-R 的早期激活可能是一种潜在的治疗策略，实际上已经通过减少 CSF 中的 S100 蛋白（脑损伤的标志物）和恢复脑自动调节（至少 48 小时）来证明在全身施用重组人 EPO 后 [Springborg 2002]。 因此，将使用 90,000 Iuof epoetin beta 在这些待研究的 SAH 患者中实现对 CBF 和自动调节的最大影响。

要回答的问题：

我们希望针对 SAH 患者提出以下假设：

1. SAH 后使用促红细胞生成素 β (90,000IU) 进行全身治疗是安全的
2. 用 epoetin beta 进行全身治疗可降低 SAH 后异常 FV 和脑自动调节的发生率。
3. 使用 epoetin beta 进行全身治疗可降低 SAH 后急性神经功能恶化的发生率 如果使用 epoetin beta 疗法改善了主要终点，则该数据将用于制定 III 期临床结果研究设计的功效计算。 然而，我们将在试验结束时和出院时评估临床结果，以检测 EPO 治疗后不良反应的任何迹象。

随机化程序：

知情同意后，血管造影阳性动脉瘤性 SAH 患者将被随机分配接受静脉注射促红细胞生成素 30,000IU 或安慰剂（0.9% 生理盐水）50 毫升/30 分钟，在 SAH 后第一周进行三次（总剂量 90,000IU）。 每组人数为 40 人。 对于盲法，药房制造单位 (PMU) 将准备含有盐水 (0.9% NaCl) 或在盐水中重构的 epoetin beta 的相同小瓶并对其编号。 这些小瓶将在登记后随机分配给患者，每个小瓶的内容只有 PMU 知道。 发作后72小时内尽快开始试用药物。 由于大约 70% 的动脉瘤将采用切开夹闭术治疗，其余的采用血管内弹簧圈治疗，我们不认为治疗方法代表污染因素，但它会包含在最终分析中。 据信罪犯动脉瘤的位置、大小和形态不会影响我们机构的结果。

在随机化和开始试验治疗后，每位患者的临床管理将照常进行。 将持续监测动脉血压（Finapress，或通过桡动脉管路）。

安全：

入院时的全血细胞计数、网织红细胞计数、血液粘度、凝血功能、血清生化、血清铁水平和 C 反应蛋白 (CRP) 将作为临床常规进行检查。 尽管 EPO 具有红细胞生成和血小板生成作用，但在短期治疗中尚未观察到相关的恶化或不良事件 [Ehrenreich 2002]。 但是，如果出现任何异常情况，将停止试验药物并通知安全委员会。 安全委员会（由肾脏病专家 Ken Smith 博士担任主席）将每月审查一次安全数据，或者如果出现问题，则逐个患者审查。

主要结果指标：血管痉挛和 AR 异常：

自 SAH 发作以来，将使用安装在专用头架上的 2-MHz 探头每天使用 TCD（DWL，德国）对试验患者进行检查两周。 收缩压、舒张压和平均 FV 将由单个用户 (MT) 记录（跨时间）。 血管痉挛被定义为平均 FV > 120 cm/sec 和 Lindegaard 比率 >3 [Lindegaard 1988]。 将计算平均 FV 和 ABP 自发变化之间的回归指数 (Mx)。 将进行两次持续 5 秒的颈动脉按压。 可接受的 THRT 的标准包括在压迫开始时大脑中动脉 FV 突然下降，压迫期间稳定的 TCD 信号，以及 FV 至少下降 30% 而没有血压不稳定 [Smielewski 1997]。 THRT 比率 (THRR) 使用以下公式计算：THRR = FVs（充血）/FVs（基线），其中 FVs 表示收缩期 FV（图 1）。 THRR 被分类为正常 (≥l.10) 或受损 (<1.10)，并将在 2 分钟后重复。 将记录两次测试的平均值。 有关 THRT 反应的质量问题已在该实验室得到广泛评估 [Smielewski 1997]。

次要终点指标： DID 的发展：

将每天监测每位患者的临床进展。 血管痉挛后局灶性神经功能缺损和/或格拉斯哥昏迷量表下降 2 分或更多将是定义 DID 发作的标准 [Pickard 1989]。 其他可能影响意识的因素，包括全身感染和中枢神经系统感染，将被记录下来以供最后分析。 临床结果将在试验结束时和出院时进行评估。 将观察住院和 NCCU 停留的持续时间。

统计分析：

将使用统计软件 STATA（美国德克萨斯州）进行分析。 数据将表示为平均值±标准偏差。 将对血管痉挛和异常 AR 的时间进行多变量分析，计算为 SAH 诊断日期与首次检测到血管痉挛和异常自动调节日期之间的天数它们的发生率：年龄、WFNS 分级、CT 扫描 Fisher 分级、治疗程序、脑室内出血和/或脑积水，使用 Cox 比例风险回归。 结果的衡量标准是风险比 (HR)，它表示特定类别相对于安慰剂组发生血管痉挛或异常自动调节的概率。 将收集与 EPO 治疗相关的变量（血细胞比容、红细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数、血清铁水平和粘度）。 将使用似然比检验在 5% 的水平上检验因每个变量引起的拟合改善是否具有统计显着性。 偏离线性趋势（一个自由度）的检验用于评估某些分类变量的潜在线性趋势。 每个患者的每日结果也将被平均以产生面向患者的数据库以满足线性回归的独立性假设。 参数的日常变化将计算为标准偏差除以每位患者所有检查的平均值。

功耗分析：

我们之前的观察表明，血管痉挛和异常 THRT 分别发生在 64% 和 90% 的 SAH 患者中。 为了以 80% 的功效和 5% 的显着性水平证明血管痉挛或异常自动调节持续时间减少 50%，我们需要对 80 名患者进行检查。 这一数量的患者也有 83% 的机会证明在发作后的前 2 周内临床 DID 的发生率降低了 50%。 尽管将寻求趋势以确定任何潜在的不良反应，但该研究并不能证明临床终点的减少。

任何可以预见的困难的细节

1. 患者招募：

   Addenbrookes 的神经外科部门每年治疗 80 名动脉瘤性 SAH 患者。 我们部门之前的研究显示出很高的确定性，我们是国际低温治疗动脉瘤手术试验 (IHAST) 的最大贡献者。 我们预计招聘不会遇到困难。

2. 安全问题：

   使用大剂量静脉注射促红细胞生成素 β (100,000IU) 治疗人类急性中风（8 小时内）的安全性和有效性已得到证实 [Ehrenreich 2002]。 EPO 的治疗范围非常广泛。 即使在非常高的血清水平下，也没有观察到副作用 [NeoRecormon 信息表，罗氏]。

3. 使用 TCD 评估 AR：

THRT 评估的质量控制已得到大力解决，未能完成测试的情况很少见 [Ratsep 2002]。 妨碍安全颈动脉压迫的严重颈动脉粥样硬化疾病的发生率低于 1% [Lam 2000]。 该测试具有良好的耐受性，我们知道没有患者因不适等原因要求退出先前研究中的调查。

未来研究

该 II 期研究的结果将用于设计使用自发性颅内出血组机制的 III 期临床结果试验。 任何潜在的好处都可以外推到其他发生低 CBF 状态和自动调节丧失的脑血管疾病（例如 急性脑血管炎）。