使用结合到未成熟卵母细胞透明带的精子进行卵胞浆内精子注射 (ICSI) 的结果

用于胞浆内单精子注射 (ICSI) 的选定精子的质量对胚胎质量和发育起着不利作用。 在体外受精 (IVF) 和精子在体内通过女性生殖道的过程中，精子与卵母细胞的透明带 (ZP) 相互作用，这是精子进入卵母细胞之前的最后选择阶段。 ZP 在结合方面具有选择性，可以结合正常功能的精子，尤其是具有正常顶体区域的精子。 根据 Liu 等人的研究，生育男性中只有 14% 的活动精子可以与 ZP 结合。 只有那些顶体区域大小和形状相对正常的精子以及那些没有或很少脱氧核糖核酸（DNA）碎片的精子才能与 ZP 结合并与卵母细胞（卵膜）的质膜（卵泡膜）融合，从而能够使卵母细胞受精。卵母细胞。 人类精子的大小、形态、DNA 完整性、运动能力、膜组成等各不相同，即使在同一精液中也能观察到这一点。 一个既定的事实是，彻底的精子选择程序发生在女性生殖道中的精子身上，以过滤优质精子，只允许一小部分质量优良的精子到达发生另一个精子选择的受精部位（即 ZP 交互）。

使体外受精有效的精子特征仍在争论中。 ICSI 现在是全球大多数辅助生殖技术 (ART) 中心的标准做法，约占所有体外受精的 70%。 ICSI 精子的常规选择取决于胚胎学家根据精子的活力和形态主观选择精子。 它是在对精液进行分析后完成的，精液是男性生育能力的较差预测工具，并且不表示精子的受精能力。 它假设模仿自然精子选择可以提高所选精子的质量，从而改善 ICSI 的临床结果。 理想情况下，一种精子选择方法可以将精子数量减少到可能具有最高质量的亚群，从而改善受精和胚胎质量和发育以及 ICSI 的后续临床结果。

多年来，已经为 ICSI 开发了几种精子选择技术。 然而，这些技术旨在根据单个精子参数（即 运动性、密度、沉降、核完整性等）并忽略与卵母细胞受精能力相关的其他精子参数。 精子选择技术，如游上游、微流体和密度梯度离心法，可以产生大量活跃的精子，但无法模拟考虑其他精子参数的严格自然精子选择。 此外，这些方法中的大多数都需要离心，这可能会对父本 DNA 产生负面影响，并通过增加活性氧来降低精子质量。 按照这些技术，胚胎学家必须根据精子的活力和形态主观选择精子，这不能保证 DNA 的完整性，而且可能很耗时。

一种相对复制自然选择的已开发精子选择方法是基于透明质酸 (HA) 结合的生理胞浆内单精子注射 (PICSI)® 培养皿。 卵母细胞周围的卵丘层主要由 HA 组成。 但是，使用 PICSI 培养皿的结果存在相互矛盾的数据。 此外，精子-ZP 结合包含 PICSI 培养皿中没有的 HA 以外的参数。

精卵相互作用是一个涉及物理和分子相互作用的多步骤过程。 它涉及 ZP 和精子上表达的表面蛋白之间复杂且基于受体/配体的互补过程。 研究揭示了几种 ZP 候选蛋白，假设它们在结合精子中发挥作用。 其中的主要蛋白质是透明带糖蛋白 3 (ZP3)，其 O 连接的寡糖链与顶体完整的精子结合并诱导顶体反应。

该研究包括 20 名接受 ICSI 的患者

我们的入选标准包括：

女性年龄≤38岁。 男性年龄≤50岁。 至少有一个未成熟的卵母细胞（即 生发泡 (GV) 或中期 I (MI) 卵母细胞）与精子孵育以保存成熟的精子用于 ICSI。

至少 10% 的精子活力和睾丸精子样本被排除在外。 根据 DNA 片段化的百分比选择患者，仅招募 ≤ 20% 的患者。 同胞卵母细胞被随机分为对照组和干预组。 对照组的卵母细胞注射了根据精子形态和活力常规选择的精子。 对于干预组，将一个未成熟卵母细胞与计算体积的处理过的精液（浓度为 500,000 个活动精子/卵母细胞）在二氧化碳 (CO2) 培养箱中孵育 10 至 30 分钟，然后在倒置显微镜下检查结合精子. 仅选择具有正常形态的结合精子并将其转移至聚乙烯吡咯烷酮（PVP）液滴中进行固定，然后注入干预组的MII卵母细胞的细胞质中。

临床操作

1. 控制性超促排卵（COH）：所有女性患者从月经周期的第3天到第5天每天皮下注射促卵泡激素（Gn，Gonal-F，默克雪兰诺，美国）。

检查卵泡是否达到适当的直径（即 18-20 毫米），并使用超声波设备测量它们的数量。 如果两个或更多卵泡达到适当的直径，则肌肉注射触发剂（人绒毛膜促性腺激素 (hCG)）（Ovitrelle®；Merck Serono，瑞士）以促进最终成熟并诱导排卵。

2-精子制备：在指导男性夫妇禁欲1至7天后，通过手淫采集精液样本。 样品在室温下置于 37ºc 的温热板或培养箱中，直至液化并记录液化时间。

宏观和微观评估均使用 2010 年世界卫生组织 (WHO) 手册作为参考进行。 然后，根据男性因素，通过以下技术之一处理样品：

对于治疗组，将特定体积的制备精液与未成熟卵母细胞在含有 10 µl 微滴全球培养基（LifeGlobal，欧洲）和 3 ml 无菌平衡矿物油覆盖层的注射盘中在 37 °C 下共同孵育6% CO2 10-30 分钟。 根据等式的体积：

x=（颗粒体积 x 0.5 x 100）/（活动力 x 计数（处理后）） 3-卵母细胞取出：在施用促排卵剂后约 36 小时进行卵母细胞取出。 在超声引导下，使用单管腔针头（Reproline，德国）以 115-120 mm Hg 的负压抽吸卵泡以快速提取卵母细胞。 同时，卵泡液已收集在圆底无菌 14 毫升猎鹰管中。 在立体显微镜下，卵母细胞-卵丘复合体 (COC) 被鉴定、洗涤并转移到施肥全球总培养基（LifeGlobal，欧洲）中，并在 6% CO2 和 37°C 下孵育直至剥落。

4- 卵母细胞剥脱和评分：通过将 COC 放入含有 80 IU/ml 透明质酸酶（LifeGlobal，欧洲）的 100 µ1 滴缓冲培养基中 30 至 45 秒来剥脱 COC。 然后用无菌移液管轻轻吸进和吸出卵母细胞，从而去除冠状细胞 (25)。 之后，全球总 w/HEPES 缓冲液（LifeGlobal，欧洲）被用来清洗剥去的卵母细胞。 配备自动操纵器、Narishige、热载物台和霍夫曼光学器件 (Olympus 1x71) 的倒置显微镜用于评估卵母细胞的成熟度。 卵母细胞成熟评估如下：成熟卵母细胞处于以极体挤出为特征的中期 II (MII)，未成熟卵母细胞处于以生发泡居中为特征的生发泡期 (GV) 或处于中期I (MI) 的特征是极体和生发泡均缺失。 然后将成熟的卵母细胞在 Labotect 培养箱中的培养基中在 37 ºC 的 6% Co2 中孵育，直到进行胞质内单精子注射。 相反，同胞未成熟卵母细胞在含有 5000 浓度精子/卵母细胞的培养基 (50 µ) 中孵育，并在 Labotect 孵化器中孵育 10-30 分钟，直至选择精子。

5- ICSI：将成熟卵母细胞置于 10 µl 微滴全球总含 HEPES 缓冲液（LifeGlobal，欧洲）中，覆盖 3ml 用于 ICSI 的纯平衡矿物油。

在对照组中，每个 MII 卵母细胞在经过密度梯度离心 (DGC) 处理后，根据形态学和运动能力常规选择的精子进行注射。 然而，在治疗组中，通过使用微针（Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA）从未成熟卵母细胞表面选择 ZP 结合精子，并将其转移到 10% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 溶液（SAGE，美国），固定化，然后用于注射同胞 MII 卵母细胞。 该过程是在倒置显微镜下进行的，该显微镜配备了用于处理卵母细胞的微负压吸管和用于注射精子的注射针。 用于精子选择的未成熟卵母细胞被丢弃。 在所有组中，含有单个精子的注射针稳定而缓慢地穿过MII卵母细胞的细胞质，并滴入1至3μl至卵母细胞的中心。

6- 结果测量：所有胚胎学参数（即 受精、卵裂、胚泡形成和胚泡质量）被记录和评估。 ICSI 后 16-18 小时观察到受精迹象。 此外，在 ICSI 后 48 和 72 小时，对切割率进行了评估。 在 ICSI 后第五天评估胚泡形成率。 具有高质量囊胚形成的胚胎根据加德纳囊胚分级系统进行分类。 该系统根据内细胞质量 (ICM) 和滋养外胚层 (TE) 质量对扩展和孵化状态进行分级。 优质胚泡被分类为具有 6、5、4 或 3AA、AB 或 BA 的胚泡。 具有 6、5、4 或 3 BB 的囊胚质量一般。

7-统计分析将受精率、卵裂率、囊胚形成率和高质量囊胚率报告为每组的百分比。 男性和女性患者的特征（年龄、精子数量、精子活力、精子形态、回收的卵母细胞数量以及成熟和未成熟卵母细胞的数量）表示为平均值±标准偏差 (SD)。 学生 t 检验用于比较连续变量（受精率、卵裂、胚泡形成和高质量胚泡）。 使用SPSS 13.0进行统计分析。 P 值≤ 0.05 被认为具有统计学意义。