Ergebnisse der Verwendung von an die Zona Pellucida unreifer Eizellen gebundenen Spermien zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI)

Die Qualität der ausgewählten Spermien, die für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) verwendet werden, spielt eine nachteilige Rolle für die Qualität und Entwicklung des Embryos. Bei der In-vitro-Fertilisation (IVF) und während der Spermienreise durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt in vivo interagieren die Spermien mit der Zona pellucida (ZP) der Eizelle, der letzten Stufe der Spermienselektion vor dem Eintritt in die Eizelle. Das ZP ist hinsichtlich der Bindung selektiv und kann an normal funktionierende Spermien binden, insbesondere an solche mit einer normalen akrosomalen Region. Laut Liu et al. können bei fruchtbaren Männern nur 14 % der beweglichen Spermien an das ZP binden. Nur Spermien mit relativ normaler Größe und Form der akrosomalen Region und solche mit keiner oder nur geringer Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Fragmentierung können an das ZP binden und mit der Plasmamembran der Eizelle (Oolemma) verschmelzen und sind somit in der Lage, die Eizelle zu befruchten Eizelle. Menschliche Spermien variieren in Größe, Morphologie, DNA-Integrität, Beweglichkeit, Membranzusammensetzung usw. und dies kann sogar im selben Ejakulat beobachtet werden. Es ist eine Tatsache, dass gründliche Spermienselektionsverfahren auf Spermien im weiblichen Genitaltrakt angewendet werden, um hochwertige Spermien herauszufiltern und nur einer kleinen Subpopulation von Spermien mit höchster Qualität zu ermöglichen, den Ort der Befruchtung zu erreichen, wo eine weitere Spermienselektion stattfindet (d. h. ZP-Interaktion).

Die Spermienmerkmale, die eine In-vitro-Fertilisation wirksam machen, werden immer noch diskutiert. ICSI ist heute die Standardpraxis für die meisten Zentren für assistierte Reproduktionstechnologien (ART) weltweit und macht etwa 70 % aller In-vitro-Fertilisationen aus. Die routinemäßige Auswahl von Spermien für die ICSI hängt davon ab, dass ein Embryologe die Spermien subjektiv anhand ihrer Motilität und Morphologie auswählt. Sie erfolgt nach einer Analyse der Samenflüssigkeit, die ein schlechtes Vorhersageinstrument für die männliche Fruchtbarkeit darstellt und keinen Rückschluss auf die Befruchtungsfähigkeit der Spermien gibt. Man ging davon aus, dass die Nachahmung der natürlichen Spermienselektion die Qualität ausgewählter Spermien und damit die klinischen Ergebnisse der ICSI verbessern könnte. Im Idealfall kann eine Spermienauswahlmethode, die die Anzahl der Spermien auf eine Subpopulation mit potenziell höchster Qualität reduziert, die Befruchtung und die Qualität und Entwicklung des Embryos sowie die daraus resultierenden klinischen Ergebnisse der ICSI verbessern.

Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Techniken zur Spermienauswahl für ICSI entwickelt. Diese Techniken wurden jedoch entwickelt, um Spermien anhand eines einzigen Spermienparameters auszuwählen (d. h. Motilität, Dichte, Sedimentation, Kernintegrität usw.) und das Ignorieren anderer Spermienparameter im Zusammenhang mit der Fähigkeit, die Eizelle zu befruchten. Spermienselektionstechniken wie Swim-up, Mikrofluidik und Dichtegradientenzentrifugation führen zu einer Population hochbeweglicher Spermien, können jedoch nicht die strenge natürliche Spermienselektion nachahmen, die andere Spermienparameter berücksichtigt. Darüber hinaus erfordern die meisten dieser Methoden eine Zentrifugation, die sich negativ auf die väterliche DNA auswirken und die Qualität der Spermien durch die Zunahme reaktiver Sauerstoffspezies verringern kann. Bei diesen Techniken muss ein Embryologe die Spermien subjektiv anhand ihrer Beweglichkeit und Morphologie auswählen, was keine DNA-Integrität garantiert und möglicherweise zeitaufwändig ist.

Eine der entwickelten Spermienselektionsmethoden, um die natürliche Selektion relativ zu duplizieren, ist die auf Hyaluronsäure (HA)-Bindung basierende Physiologische intrazytoplasmatische Spermieninjektion (PICSI)®-Schalen. Die die Eizelle umgebende Cumulus-oophorus-Schicht besteht hauptsächlich aus HA. Es gibt jedoch widersprüchliche Daten zu den Ergebnissen mit PICSI-Gerichten. Darüber hinaus umfasst die Spermien-ZP-Bindung andere Parameter als HA, die in PICSI-Schalen nicht vorkommen.

Die Interaktion zwischen Spermien und Eizellen ist ein mehrstufiger Prozess, der physikalische und molekulare Wechselwirkungen umfasst. Dabei handelt es sich um einen komplexen und komplementären Rezeptor/Liganden-basierten Prozess zwischen den auf dem ZP exprimierten Oberflächenproteinen und dem Sperma. Die Forschung hat mehrere ZP-Proteinkandidaten enthüllt, von denen angenommen wird, dass sie eine Rolle bei der Bindung von Spermien spielen. Das Hauptprotein davon ist das Zona pellucida-Glykoprotein 3 (ZP3), dessen O-verknüpfte Oligosaccharidketten an ein akrosomentaktes Spermium binden und eine akrosomale Reaktion auslösen.

Die Studie umfasste 20 Patienten, die sich einer ICSI unterzogen

Zu unseren Einschlusskriterien gehörten:

Alter der Frau ≤ 38 Jahre. Männliches Alter ≤ 50 Jahre. Mindestens eine unreife Eizelle (d. h. Keimbläschen (GV) oder Metaphase I (MI)-Oozyten) zur Inkubation mit Spermien, um reife Spermien für die ICSI zu konservieren.

Mindestens 10 % Spermienmotilität und somit testikuläre Spermienproben wurden ausgeschlossen. Die Patienten wurden anhand des Prozentsatzes der DNA-Fragmentierung ausgewählt und nur diejenigen mit ≤ 20 % wurden rekrutiert. Die Eizellen der Geschwister wurden nach dem Zufallsprinzip in eine Kontroll- und eine Interventionsgruppe aufgeteilt. Den Oozyten der Kontrollgruppe wurden konventionell ausgewählte Spermien auf der Grundlage der Spermienmorphologie und -motilität injiziert. Für die Interventionsgruppe wurde eine unreife Eizelle mit einem berechneten Volumen des verarbeiteten Samens mit einer Konzentration von 500.000 beweglichen Spermien/Eizelle in einem Kohlendioxid-Inkubator (CO2) 10 bis 30 Minuten lang inkubiert und dann unter einem Umkehrmikroskop auf gebundene Spermien untersucht . Nur gebundene Spermien mit normaler Morphologie wurden ausgewählt und zur Immobilisierung in einen Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Tropfen überführt und dann in das Zytoplasma der MII-Oozyten der Interventionsgruppen injiziert.

Klinische Manipulationen

1. Kontrollierte ovarielle Hyperstimulation (COH): Allen Patientinnen wurde vom 3. bis 5. Tag des Menstruationszyklus täglich ein subkutanes follikelstimulierendes Hormon (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Vereinigte Staaten von Amerika) injiziert.

Die Follikel wurden daraufhin überprüft, ob sie den richtigen Durchmesser erreichten (d. h. 18-20 mm) und deren Anzahl mit einem Ultraschallgerät bestimmt. Wenn zwei oder mehr Follikel den entsprechenden Durchmesser erreichten, wurde ein Auslöser (humanes Choriongonadotropin (hCG)) (Ovitrelle®; Merck Serono, Schweiz) intramuskulär verabreicht, um die endgültige Reifung zu fördern und den Eisprung auszulösen.

2-Spermienvorbereitung: Nachdem männliche Paare angewiesen worden waren, 1 bis 7 Tage lang auf sexuelle Aktivitäten zu verzichten, wurden Samenproben durch Masturbation entnommen. Die Proben wurden bei Raumtemperatur auf warme Platten oder Inkubatoren bei 37 °C gelegt, bis sie verflüssigt waren, und der Zeitpunkt der Verflüssigung wurde aufgezeichnet.

Sowohl makroskopische als auch mikroskopische Untersuchungen wurden unter Verwendung des Handbuchs der Weltgesundheitsorganisation (WHO) von 2010 als Referenz durchgeführt. Anschließend wurden die Proben je nach männlichem Faktor mit einer der folgenden Techniken behandelt:

Für die Behandlungsgruppen wurde ein spezifisches Volumen des vorbereiteten Samens zusammen mit einer unreifen Eizelle in einer Injektionsschale mit 10 µl Mikrotropfen Global Media (LifeGlobal, Europa) mit 3 ml sterilem, äquilibriertem Mineralölüberzug bei 37 °C inkubiert mit 6 % CO2 für 10-30 Minuten. Das Volumen nach der Gleichung:

x = (Pelletvolumen x 0,5 x 100)/(Motilität x Anzahl (nach der Verarbeitung)) 3-Oozyten-Entnahme: Die Eizellen-Entnahme erfolgte etwa 36 Stunden nach der Verabreichung des Ovulationsauslösers. Unter Ultraschallführung wurden die Follikel mit einer einlumigen Nadel (Reproline, Deutschland) abgesaugt, um eine schnelle Eizellentnahme mit einem Unterdruck von 115–120 mm Hg zu ermöglichen. Gleichzeitig wurde die Follikelflüssigkeit in sterilen 14-ml-Falcon-Röhrchen mit rundem Boden gesammelt. Unter einem Stereomikroskop wurden die Oozyten-Cumulus-Komplexe (COCs) identifiziert, gewaschen und in befruchtende globale Gesamtmedien (LifeGlobal, Europa) überführt und bei 6 % CO2 bei 37 °C bis zur Entblößung inkubiert.

4- Entblößung und Bewertung der Eizellen: Die COCs wurden entblößt, indem sie 30 bis 45 Sekunden lang in einen 100 µ1 Tropfen gepuffertes Medium mit 80 IU/ml Hyaluronidase-Enzym (LifeGlobal, Europa) gegeben wurden. Dann wurden die Eizellen vorsichtig mit einer sterilen Stripper-Pipette angesaugt, was zur Entfernung der koronalen Zellen führte (25). Anschließend wurde ein globaler Gesamt-W/HEPES-Puffer (LifeGlobal, Europa) verwendet, um die entblößten Eizellen zu waschen. Zur Beurteilung der Reife der Eizellen wurde ein inverses Mikroskop verwendet, das mit automatischen Manipulatoren, Narishige, einem heißen Tisch und einer Hoffman-Optik (Olympus 1x71) ausgestattet war. Die Beurteilung der Eizellenreifung war wie folgt: Reife Eizellen befanden sich in der Metaphase II (MII), gekennzeichnet durch die Extrusion des Polkörperchens, und unreife Eizellen befanden sich entweder in der Keimbläschenphase (GV), gekennzeichnet durch ein zentral gelegenes Keimbläschen, oder in der Metaphase I (MI) ist durch das Fehlen sowohl des Polkörperchens als auch der Keimbläschen gekennzeichnet. Reife Eizellen wurden dann in einem Kulturmedium in einem Labotect-Inkubator mit 6 % Co2 bei 37 °C bis zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion inkubiert. Im Gegensatz dazu wurden unreife Geschwister-Eizellen in einem Kulturmedium (50 µ) mit einer Konzentration von 5000 Spermien/Eizellen inkubiert und bis zur Spermienselektion 10 bis 30 Minuten lang in den Labotect-Inkubator gegeben.

5- ICSI: Reife Eizellen wurden in 10 µl Mikrotropfen des globalen Gesamt-HEPES-Puffers (LifeGlobal, Europa) gegeben, bedeckt mit 3 ml reinem, äquilibriertem Mineralöl für ICSI.

In der Kontrollgruppe wurde jeder MII-Oozyte ein konventionell ausgewähltes Sperma basierend auf Morphologie und Motilität injiziert, nachdem es durch Dichtegradientenzentrifugation (DGC) verarbeitet wurde. In den Behandlungsgruppen wurden jedoch ZP-gebundene Spermien mithilfe einer Mikronadel (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) von der Oberfläche der unreifen Eizellen ausgewählt und in eine 10 %ige Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Lösung (SAGE, USA), immobilisiert und dann zur Injektion von Geschwister-MII-Oozyten verwendet. Der Eingriff wurde unter einem Umkehrmikroskop durchgeführt, das mit einer Haltepipette mit leichtem Unterdruck zur Handhabung der Eizelle und einer Injektionsnadel zur Injektion des Spermas ausgestattet war. Die zur Spermienselektion verwendeten unreifen Eizellen wurden verworfen. In allen Gruppen wurde die Injektionsnadel, die ein einzelnes Spermium enthielt, gleichmäßig und langsam durch das Zytoplasma der MII-Oozyte bewegt und ließ 1 bis 3 µl in die Mitte der Oozyte fallen.

6- Ergebnismaße: Alle embryologischen Parameter (d. h. Befruchtung, Spaltung, Blastozystenbildung und Blastozystenqualität) wurden aufgezeichnet und bewertet. Anzeichen einer Befruchtung wurden 16–18 Stunden nach der ICSI beobachtet. Darüber hinaus wurde 48 und 72 Stunden nach ICSI die Spaltungsrate beurteilt. Die Blastozystenbildungsrate wurde am fünften Tag nach der ICSI beurteilt. Embryonen mit qualitativ hochwertiger Blastozystenbildung wurden nach dem Blastozysten-Bewertungssystem von Gardner klassifiziert. Dieses System weist Stufen des Expansions- und Schlüpfstatus entsprechend der inneren Zellmasse (ICM) und der Qualität des Trophektoderms (TE) zu. Blastozysten guter Qualität wurden als Blastozysten mit 6, 5, 4 oder 3AA, AB oder BA klassifiziert. Blastozysten von angemessener Qualität waren solche mit 6, 5, 4 oder 3 BB.

7-Statistische Analyse Die Befruchtungs-, Spaltungs-, Blastozystenbildungs- und qualitativ hochwertigen Blastozystenraten wurden als Prozentsätze für jede Gruppe angegeben. Merkmale männlicher und weiblicher Patienten (Alter, Spermienzahl, Spermienmotilität, Spermienmorphologie, Anzahl der entnommenen Eizellen sowie Anzahl reifer und unreifer Eizellen) wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Der Student-T-Test wurde verwendet, um kontinuierliche Variablen (Befruchtungsraten, Spaltung, Blastozystenbildung und hochwertige Blastozysten) zu vergleichen. Die statistische Analyse wurde mit SPSS 13.0 durchgeführt. Ein P-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.