Epäkypsien munasolujen Zona Pellucidaan sitoutuneen siittiöiden käytön tulos intrasytoplasmiseen siittiöinjektioon (ICSI)

Valittujen siittiöiden laadulla, jota käytetään intrasytoplasmiseen siittiöinjektioon (ICSI), on haitallinen rooli alkion laadussa ja kehityksessä. Koeputkihedelmöityksessä (IVF) ja siittiöiden matkan aikana naisen lisääntymiskanavan läpi in vivo siittiöt ovat vuorovaikutuksessa munasolun zona pellucidan (ZP) kanssa, mikä on siittiöiden valinnan viimeinen vaihe ennen munasoluun pääsyä. ZP on selektiivinen sitoutumisen suhteen ja voi sitoutua normaalisti toimiviin siittiöihin, erityisesti niihin, joilla on normaali akrosomialue. Liu et al.:n mukaan vain 14 % hedelmällisten miesten liikkuvista siittiöistä voi sitoutua ZP:hen. Ainoastaan ​​ne siittiöt, joiden akrosomaalisen alueen koko ja muoto on suhteellisen normaali, ja ne, joissa ei ole tai on vähän deoksiribonukleiinihappofragmentoitumista (DNA), voivat sitoutua ZP:hen ja fuusioitua munasolun plasmakalvoon (oolemma) ja pystyvät siten hedelmöittämään varhaismunasolu. Ihmisen siittiöiden koko, morfologia, DNA:n eheys, liikkuvuus, kalvokoostumus jne. vaihtelevat, ja tämä voidaan havaita jopa samassa siemensyöksyssä. On itsestään selvää, että naisen sukupuolielinten siittiöihin kohdistuu perusteellisia siittiöiden valintamenettelyjä, jotka suodattavat paremmat siittiöt ja sallivat vain pienen korkealaatuisen siittiöiden osajoukon päästä hedelmöityskohtaan, jossa tapahtuu toinen siittiöiden valinta (esim. ZP-vuorovaikutus).

Siittiöiden ominaisuuksista, jotka tekevät koeputkihedelmöityksen tehokkaaksi, keskustellaan edelleen. ICSI on nykyään vakiokäytäntö useimmissa ART-keskuksissa maailmanlaajuisesti, ja sen osuus on noin 70 % kaikesta koeputkihedelmöityksestä. Siittiöiden rutiinivalinta ICSI:tä varten riippuu siitä, että embryologi valitsee subjektiivisesti siittiöitä niiden liikkuvuuden ja morfologian perusteella. Se tehdään siemennesteen analyysin jälkeen, joka on huono miehen hedelmällisyyden ennustamistyökalu eikä ilmaise siittiöiden hedelmöityskykyä. Se oli olettanut, että luonnollisen siittiöiden valinnan matkiminen voi parantaa valittujen siittiöiden laatua ja siten ICSI:n kliinisiä tuloksia. Ihannetapauksessa siittiöiden määrää vähentävä siittiöiden lukumäärä mahdollisesti laadukkaimpaan osapopulaatioon voi parantaa hedelmöittymisen ja alkion laatua ja kehitystä ja myöhempiä ICSI:n kliinisiä tuloksia.

Vuosien varrella ICSI:lle on kehitetty useita siittiöiden valintatekniikoita. Nämä tekniikat on kuitenkin suunniteltu valitsemaan siittiöitä yhden siittiöparametrin perusteella (esim. liikkuvuus, tiheys, sedimentaatio, tuman eheys jne.) ja jättää huomiotta muut siittiöiden parametrit, jotka liittyvät munasolun hedelmöittämiskykyyn. Siittiöiden valintatekniikat, kuten uiminen, mikrofluidiikka ja tiheysgradienttisentrifugointi, tuottavat erittäin liikkuvan siittiön populaation, mutta eivät jäljittele tiukkaa luonnollista siittiöiden valintaa, joka ottaa huomioon muut siittiöiden parametrit. Lisäksi useimmat näistä menetelmistä vaativat sentrifugoinnin, mikä voi vaikuttaa negatiivisesti isän DNA:han ja heikentää siittiöiden laatua lisäämällä reaktiivisia happilajeja. Näitä tekniikoita noudattaen embryologin on subjektiivisesti valittava siittiöt niiden liikkuvuuden ja morfologian perusteella, mikä ei takaa DNA:n eheyttä ja on mahdollisesti aikaa vievää.

Yksi kehitetyistä siittiöiden valintamenetelmistä luonnollisen valinnan suhteellisen monistamiseksi on hyaluronihappoon (HA) sitoutumiseen perustuva fysiologinen intrasytoplasminen siittiöinjektio (PICSI)® -astia. Munasolua ympäröivä cumulus oophorus -kerros koostuu pääasiassa HA:sta. PICSI-astioiden tuloksista on kuitenkin ristiriitaisia ​​tietoja. Lisäksi siittiöiden ja ZP:n sitoutuminen sisältää muita parametreja kuin HA:ta, joita ei esiinny PICSI-maljoissa.

Siittiön ja munasolun vuorovaikutus on monivaiheinen prosessi, joka sisältää fysikaalisia ja molekylaarisia vuorovaikutuksia. Se sisältää monimutkaisen ja komplementaarisen reseptori/ligandipohjaisen prosessin ZP:ssä ekspressoituneiden pintaproteiinien ja siittiöiden välillä. Tutkimus on paljastanut useita ZP-proteiiniehdokkaita, joiden oletetaan osallistuvan siittiöiden sitomiseen. Näiden pääproteiini on zona pellucida glykoproteiini 3 (ZP3), jonka O-kytketyt oligosakkaridiketjut sitoutuvat akrosomin eheään siittiöön ja aiheuttavat akrosomaalisen reaktion.

Tutkimukseen osallistui 20 potilasta, joille tehtiin ICSI

Osallistumiskriteereimme kuuluivat:

Naisen ikä ≤ 38 vuotta vanha. Miesten ikä ≤ 50 vuotta vanha. Sinulla on vähintään yksi epäkypsä munasolu (ts. iturakkula (GV) tai metafaasi I (MI) munasolu) inkubaatioon siittiöiden kanssa kypsien rakkuloiden säilyttämiseksi ICSI:tä varten.

Vähintään 10 % siittiöiden liikkuvuudesta ja siten kivesten siittiönäytteet suljettiin pois. Potilaat valittiin DNA-fragmentoitumisprosentin perusteella ja vain ne, joilla oli ≤ 20 %, rekrytoitiin. Sisarusten munasolut jaettiin satunnaisesti kontrolli- ja interventioryhmään. Kontrolliryhmän munasoluihin injektoitiin tavanomaisesti valittuja siittiöitä siittiöiden morfologian ja liikkuvuuden perusteella. Interventioryhmässä yhtä epäkypsää munasolua inkuboitiin lasketun tilavuuden kanssa prosessoitua siemennestettä, jonka pitoisuus oli 500 000 liikkuvaa siittiötä/oosyyttiä, hiilidioksidi- (CO2) -inkubaattorissa 10-30 minuuttia ja sitten tarkastettiin sitoutuneiden siittiöiden varalta käänteisellä mikroskoopilla. . Vain sitoutuneet siittiöt, joilla oli normaali morfologia, valittiin ja siirrettiin polyvinyylipyrrolidonipisaraan (PVP) immobilisointia varten ja injektoitiin sitten interventioryhmien MII-oosyyttien sytoplasmaan.

Kliiniset manipulaatiot

1. Kontrolloitu munasarjojen hyperstimulaatio (COH): Kaikille naispotilaille injektoitiin päivittäin ihonalaista follikkelia stimuloivaa hormonia (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Yhdysvallat) kuukautiskierron 3. - 5. päivänä.

Tarkastettiin, että follikkelit ovat saavuttaneet sopivan halkaisijan (esim. 18-20 mm) ja niiden lukumäärälle ultraäänilaitteella. Jos kaksi tai useampi munarakkula saavutti sopivan halkaisijan, liipaisin (ihmisen koriongonadotropiini (hCG)) (Ovitrelle®; Merck Serono, Sveitsi) annettiin lihakseen lopullisen kypsymisen edistämiseksi ja ovulaation indusoimiseksi.

2-sperman valmistelu: Kun miespareja oli ohjeistettu pidättymään seksuaalisesta toiminnasta 1-7 päivän ajan, siemennestenäytteet kerättiin itsetyydytyksellä. Näytteet asetettiin huoneenlämpötilaan lämpimille levyille tai inkubaattoreille 37 ºC:seen, kunnes ne nesteytyivät ja nesteytymisaika kirjattiin.

Sekä makroskooppiset että mikroskooppiset arvioinnit suoritettiin käyttämällä viitteenä vuoden 2010 Maailman terveysjärjestön (WHO) käsikirjaa. Sitten näytteet käsiteltiin jollakin seuraavista tekniikoista miestekijän mukaan:

Hoitoryhmiä varten tietty tilavuus valmistettua siemennestettä inkuboitiin yhdessä epäkypsän munasolun kanssa injektiomaljassa, joka sisälsi 10 µl mikropisaroita globaalia alustaa (LifeGlobal, Eurooppa) ja 3 ml steriiliä tasapainotettua mineraaliöljyä 37 °C:ssa. 6 % CO2:lla 10-30 minuuttia. Tilavuus yhtälön mukaan:

x=(pelletin tilavuus x 0,5 x 100)/(liikkuvuus x määrä (käsittelyn jälkeen)) 3-Oosyyttien haku: Munasolujen talteenotto suoritettiin noin 36 tuntia ovulaation laukaisinta. Ultraääniohjauksen alaisena yksittäistä luumenin neulaa (Reproline, Saksa) oli käytetty follikkelia imemään munasolujen nopeaa poimimista varten alipaineella 115-120 mmHg. Samanaikaisesti follikulaarinen neste oli kerätty pyöreäpohjaisiin steriileihin 14 ml falcon-putkiin. Stereomikroskoopin alla oosyytti-cumulus-kompleksit (COC:t) tunnistettiin, pestiin ja siirrettiin hedelmöittävälle globaalille kokonaiselatusaineelle (LifeGlobal, Eurooppa) ja inkuboitiin 6 % CO2:ssa 37 °C:ssa denudoitumiseen asti.

4- Oosyyttien denudaatio ja pisteytys: COC:t denudoitiin asettamalla ne 100 µ1 pisaraan puskuroitua alustaa, joka sisälsi hyaluronidaasientsyymiä 80 IU/ml (LifeGlobal, Eurooppa) 30-45 sekunniksi. Sitten munasolut aspiroitiin varovasti sisään ja ulos steriilillä strippauspipetillä, mikä johti koronaalisten solujen poistoon (25). Sen jälkeen denudoituneiden munasolujen pesuun käytettiin maailmanlaajuista kokonaismäärää HEPES-puskurilla (LifeGlobal, Eurooppa). Oosyyttien kypsyyden arvioimiseen käytettiin käänteistä mikroskooppia, joka oli varustettu automaattisilla manipuloinneilla, Narishige-, kuumalava- ja Hoffman-optiikalla (Olympus 1x71). Munasolujen kypsymisen arviointi oli seuraava: kypsät munasolut metafaasissa II (MII), jolle oli ominaista polaarisen kappaleen pursotus, ja epäkypsät munasolut olivat joko germinaalivesikkelifaasissa (GV), jolle on ominaista keskeisesti sijaitseva iturakkula tai metafaasissa. I (MI), jolle on tunnusomaista sekä polaarisen rungon että iturakkulan puuttuminen. Kypsiä munasoluja inkuboitiin sitten viljelyväliaineessa Labotect-inkubaattorissa, jossa oli 6 % Co2:ta 37 ºC:ssa intrasytoplasmiseen siittiöinjektioon asti. Sitä vastoin sisarusten epäkypsiä munasoluja inkuboitiin viljelyväliaineessa (50 u), jossa oli 5 000 ui siittiöitä/oosyyttiä, ja asetettiin Labotect-inkubaattoriin 10 - 30 minuutiksi siittiöiden valintahetkeen asti.

5- ICSI: Kypsät munasolut asetettiin 10 µl:n mikropisaroihin globaalia kokonaismäärää HEPES-puskuria (LifeGlobal, Eurooppa) peitettynä 3 ml:lla puhdasta tasapainotettua mineraaliöljyä ICSI:tä varten.

Kontrolliryhmässä jokaiseen MII-oosyyttiin injektoitiin tavanomaisesti valittu siittiö morfologian ja liikkuvuuden perusteella sen jälkeen, kun se oli prosessoitu tiheysgradienttisentrifugoinnilla (DGC). Hoitoryhmissä ZP:hen sitoutuneet siittiöt valittiin kuitenkin epäkypsien munasolujen pinnalta mikroneulaa käyttämällä (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) ja siirrettiin 10 % polyvinyylipyrrolidoni (PVP) -liuokseen (SAGE, USA), immobilisoitiin ja käytettiin sitten sisarusten MII-oosyyttien injektoimiseen. Toimenpide suoritettiin käänteisessä mikroskoopissa, joka oli varustettu pitopipetillä, jossa oli lievä alipaine munasolun käsittelyä varten, ja injektioneula siittiöiden injektoimiseksi. Siittiöiden valintaan käytetyt epäkypsät munasolut hylättiin. Kaikissa ryhmissä yhden siittiön sisältävä injektioneula liikkui tasaisesti ja hitaasti MII-oosyytin sytoplasman läpi ja pudotettiin 1 - 3 µl munasolun keskelle.

6- Tulosmitat: Kaikki alkioparametrit (esim. hedelmöitys, pilkkoutuminen, blastokystan muodostuminen ja blastokystien laatu) kirjattiin ja arvioitiin. Merkkejä hedelmöityksestä havaittiin 16-18 tuntia ICSI:n jälkeen. Lisäksi 48 ja 72 tuntia ICSI:n jälkeen pilkkoutumisnopeus arvioitiin. Blastokystin muodostumisnopeus arvioitiin viidentenä päivänä ICSI:n jälkeen. Alkiot, joissa oli korkealaatuista blastokystamuodostusta, luokiteltiin Gardnerin blastokystaluokitusjärjestelmän mukaan. Tämä järjestelmä määrittää laajenemis- ja kuoriutumistilan asteet sisäisen solumassan (ICM) ja trofektodermin (TE) laadun mukaan. Hyvälaatuiset blastokystit luokiteltiin sellaisiksi, joilla on 6, 5, 4 tai 3AA, AB tai BA. Kohtuullisen laadukkaat blastokystit olivat 6, 5, 4 tai 3 BB:tä.

7-Tilastollinen analyysi Hedelmöittymis-, pilkkoutumis-, blastokystien muodostumisnopeudet ja korkealaatuiset blastokystit ilmoitettiin prosentteina jokaiselle ryhmälle. Mies- ja naispotilaiden ominaisuudet (ikä, siittiöiden määrä, siittiöiden liikkuvuus, siittiöiden morfologia, talteen otettujen munasolujen määrä sekä kypsien ja epäkypsien munasolujen lukumäärä) ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Studentin t-testiä käytettiin vertailemaan jatkuvia muuttujia (hedelmöitysasteet, pilkkoutuminen, blastokystien muodostuminen ja korkealaatuiset blastokystit). Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 13.0:lla. P-arvoa ≤ 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.