Resultatet af brug af sæd bundet til Zona Pellucida af umodne oocytter til intracytoplasmatisk sædinjektion (ICSI)

Kvaliteten af ​​den udvalgte sperm, der anvendes til intracytoplasmatisk spermainjektion (ICSI), spiller en skadelig rolle for embryonal kvalitet og udvikling. Ved in vitro fertilisering (IVF) og under sædtransporten gennem den kvindelige forplantningskanal in vivo, interagerer sædceller med zona pellucida (ZP) af oocytten, som er det sidste stadie af sædselektion, før den kommer ind i oocytten. ZP er selektiv med hensyn til binding og kan binde til normalt fungerende sædceller, især dem med en normal akrosomal region. Ifølge Liu et al. kan kun 14 % af de bevægelige spermatozoer hos fertile mænd binde sig til ZP. Kun de spermatozoer med relativt normal størrelse og form af den acrosomale region og dem med ingen eller lav deoxyribonukleinsyre (DNA) fragmentering kan binde til og ZP og smelte sammen med plasmamembranen af ​​oocytten (oolemma) og er således i stand til at befrugte oocyt. Menneskelige sædceller varierer i størrelse, morfologi, DNA-integritet, motilitet, membransammensætning osv., og dette kan observeres selv i samme ejakulat. Det er en given kendsgerning, at grundige sædselektionsprocedurer rammer sædceller i kvindens kønsorganer for at filtrere overlegne sædceller og tillade kun en lille underpopulation af sædceller med overlegen kvalitet at nå befrugtningsstedet, hvor en anden sædselektion finder sted (dvs. ZP interaktion).

De sædegenskaber, der gør in vitro-befrugtning effektiv, diskuteres stadig. ICSI er nu standardpraksis for de fleste centre for assisteret reproduktionsteknologi (ART) verden over og tegner sig for cirka 70 % af al in vitro-fertilisering. Den rutinemæssige udvælgelse af spermatozoer til ICSI afhænger af, at en embryolog subjektivt udvælger sperm baseret på deres motilitet og morfologi. Det sker efter en analyse af sædvæsken, som er et dårligt prædiktivt værktøj for mandlig fertilitet og ikke udtrykker sædcellens befrugtningskapacitet. Den havde antaget, at efterligning af den naturlige sædselektion kan forbedre kvaliteten af ​​udvalgte spermatozoer og dermed de kliniske resultater af ICSI. Ideelt set kan en sædselektionsmetode, der reducerer antallet af spermatozoer til en subpopulation med potentielt den højeste kvalitet, forbedre befrugtning og embryokvalitet og -udvikling og efterfølgende kliniske resultater af ICSI.

Gennem årene er der udviklet adskillige sædselektionsteknikker til ICSI. Imidlertid blev disse teknikker designet til at vælge sæd baseret på en enkelt sædparameter (dvs. motilitet, tæthed, sedimentation, nuklear integritet osv.) og ignorerer andre sædparametre relateret til evnen til at befrugte oocytten. Sædselektionsteknikker såsom swim-up, mikrofluidik og tæthedsgradientcentrifugering giver en population af meget bevægelige sædceller, men undlader at efterligne den strenge naturlige sædselektion, der tager andre sædparametre i betragtning. Desuden kræver de fleste af disse metoder centrifugering, hvilket kan påvirke det faderlige DNA negativt og reducerer sædkvaliteten ved at øge reaktive oxygenarter. Ved at følge disse teknikker skal en embryolog subjektivt udvælge sædceller baseret på deres motilitet og morfologi, hvilket ikke garanterer DNA-integritet og er potentielt tidskrævende.

En af de udviklede sædselektionsmetoder til relativt at duplikere den naturlige selektion er de hyaluronsyre (HA) bindingsbaserede Physiological intracytoplasmic sperm injection (PICSI)® skåle. Cumulus oophorus-laget, der omgiver oocytten, består hovedsageligt af HA. Der er dog modstridende data om resultaterne ved brug af PICSI-retter. Desuden omfatter sperm-ZP-binding andre parametre end HA, der ikke er med i PICSI-retter.

Sperm-oocyt-interaktion er en flertrinsproces, der involverer fysiske og molekylære interaktioner. Det involverer en kompleks og komplementær receptor/ligand-baseret proces mellem overfladeproteinerne udtrykt på ZP og sæden. Forskning har afsløret adskillige ZP-proteinkandidater, der postuleres at spille en rolle i binding af sæd. Hovedproteinet af disse er zona pellucida glycoprotein 3 (ZP3), hvis O-bundne oligosaccharidkæder binder til en akrosom-intakt sædcelle og inducerer en akrosomal reaktion.

Undersøgelsen bestod af 20 patienter, der gennemgår ICSI

Vores inklusionskriterier omfattede:

Kvinde alder ≤ 38 år. Mand alder ≤ 50 år gammel. At have mindst én umoden oocyt (dvs. germinal vesikel (GV) eller Metafase I (MI) oocyt) til inkubation med sæd for at bevare modne for ICSI.

Mindst 10 % spermmotilitet og dermed testikelspermprøver blev udelukket. Patienterne blev udvalgt baseret på procentdelen af ​​DNA-fragmentering, og kun dem med ≤ 20% blev rekrutteret. Søskende-oocytter blev tilfældigt opdelt i en kontrol- og en interventionsgruppe. Oocytter fra kontrolgruppen blev injiceret med konventionelt udvalgte spermatozoer baseret på spermmorfologi og -motilitet. For interventionsgruppen blev en umoden oocyt inkuberet med et beregnet volumen af ​​den behandlede sæd med en koncentration på 500.000 bevægelige sædceller/oocyt i en kuldioxid (CO2) inkubator i 10 til 30 minutter og derefter kontrolleret for bundet sæd under et omvendt mikroskop . Kun bundet sperm med normal morfologi blev udvalgt og overført til en polyvinylpyrrolidon (PVP) dråbe til immobilisering og derefter injiceret i cytoplasmaet af MII oocytterne i interventionsgrupperne.

Kliniske manipulationer

1. Kontrolleret ovariehyperstimulering (COH): Alle kvindelige patienter blev dagligt injiceret med et subkutant follikelstimulerende hormon (Gn, Gonal-F, Merck Serono, USA) fra den 3. til den 5. dag i menstruationscyklussen.

Folliklerne blev kontrolleret for at nå den passende diameter (dvs. 18-20 mm) og for deres antal ved hjælp af en ultralydsanordning. Hvis to eller flere follikler nåede den passende diameter, blev en trigger (humant choriongonadotropin (hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Schweiz) administreret intramuskulært for at fremme den endelige modning og inducere ægløsning.

2-sperm forberedelse: Efter at mandlige par var blevet instrueret i at afholde sig fra seksuelle aktiviteter i 1 til 7 dage, blev sædprøver indsamlet ved onani. Prøver blev anbragt ved stuetemperatur på varme plader eller inkubatorer ved 37ºC, indtil de blev gjort flydende, og tidspunktet for fortætning blev registreret.

Både makroskopiske og mikroskopiske vurderinger blev udført med 2010 World Health Organizations (WHO) manual som reference. Derefter blev prøver behandlet med en af ​​følgende teknikker afhængigt af den mandlige faktor:

For behandlingsgrupperne blev et specifikt volumen af ​​den forberedte sæd co-inkuberet med en umoden oocyt i en injektionsskål indeholdende 10 µl mikrodråber globalt medium (LifeGlobal, Europa) med 3 ml sterilt ækvilibreret mineralolie-overlay ved 37 °C med 6 % CO2 i 10-30 minutter. Volumen ifølge ligningen:

x=(pelletvolumen x 0,5 x 100)/(motilitet x antal (efter bearbejdning)) 3-Oocytudhentning: Oocytudvinding blev udført ca. 36 timer efter administrationen af ​​ægløsningstriggeren. Under ultralydsvejledning var en enkelt lumen gauge nål (Reproline, Tyskland) blevet brugt til at aspirere folliklerne til hurtig oocytopsamling med et undertryk på 115-120 mm Hg. Samtidig var follikelvæsken blevet opsamlet i rundbundede sterile 14 ml falkerør. Under et stereomikroskop blev oocyt-cumulus-komplekserne (COC'er) identificeret, vasket og overført til befrugtende globale samlede medier (LifeGlobal, Europa) og inkuberet ved 6% CO2 ved 37 °C indtil denudering.

4- Oocyt-denudering og scoring: COC'erne blev denuderet ved at placere dem i en 100 µ1 dråbe buffermedie indeholdende hyaluronidase-enzym 80 IU/ml (LifeGlobal, Europa) i 30 til 45 sekunder. Derefter blev oocytterne forsigtigt aspireret ind og ud af en steril stripperpipette, hvilket resulterede i fjernelse af koronale celler (25). Derefter blev en global total m/HEPES-buffer (LifeGlobal, Europa) brugt til at vaske de denuderede oocytter. Et omvendt mikroskop udstyret med automatiske manipulatorer, Narishige, hot stage og Hoffman-optik (Olympus 1x71) blev brugt til at vurdere oocytternes modenhed. Vurderingen af ​​oocytmodningen var som følger: modne oocytter i metafase II (MII) karakteriseret ved ekstrudering af det polære legeme, og umodne oocytter var enten i germinal vesikelfase (GV) karakteriseret ved en centralt placeret germinal vesikel eller i metafasen I (MI) karakteriseret ved fraværet af både den polære krop og den germinale vesikel. Modne oocytter blev derefter inkuberet i et dyrkningsmedium i en Labotect-inkubator med 6% Co2 ved 37 ºC indtil tidspunktet for den intracytoplasmatiske spermainjektion. I modsætning hertil blev søskende umodne oocytter inkuberet i et dyrkningsmedium (50 µ) med en 5000 koncentration af spermatozoer/oocyt og anbragt i Labotect-inkubatoren i 10-30 minutter indtil tidspunktet for sædselektion.

5- ICSI: Modne oocytter blev anbragt i 10 µl mikrodråber af den globale total m/HEPES-buffer (LifeGlobal, Europa) dækket med 3 ml ren ækvilibreret mineralolie til ICSI.

I kontrolgruppen blev hver MII oocyt injiceret med en konventionelt udvalgt sperm baseret på morfologi og motilitet efter at være blevet behandlet ved densitetsgradientcentrifugering (DGC). I behandlingsgrupperne blev ZP-bundet sæd imidlertid udvalgt fra overfladen af ​​de umodne oocytter ved brug af en mikronål (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) og overført i en 10 % polyvinylpyrrolidon (PVP) opløsning (SAGE, USA), immobiliseret og derefter brugt til at injicere søskende MII oocytter. Proceduren blev udført under et omvendt mikroskop udstyret med en holdepipette med let undertryk til håndtering af oocytten og en injektionsnål til injektion af sæden. De umodne oocytter anvendt til sædselektion blev kasseret. I alle grupper blev injektionsnålen, der indeholdt en enkelt sperm, støt og langsomt bevæget gennem MII-oocyttens cytoplasma og faldt 1 til 3 µl til midten af ​​oocytten.

6- Resultatmål: Alle de embryologiske parametre (dvs. befrugtning, spaltning, blastocystdannelse og blastocystkvalitet) blev registreret og vurderet. Tegn på befrugtning blev observeret 16-18 timer efter ICSI. Endvidere, 48 og 72 timer efter ICSI, blev spaltningshastigheden vurderet. Blastocystdannelseshastigheden blev vurderet på dag fem efter ICSI. Embryoer med blastocystdannelse af høj kvalitet blev klassificeret i henhold til Gardners blastocystklassificeringssystem. Dette system tildeler grader af ekspansions- og klækningsstatus i henhold til indre cellemasse (ICM) og trophectoderm (TE) kvalitet. Blastocyster af god kvalitet blev klassificeret som dem med 6, 5, 4 eller 3AA, AB eller BA. Blastocyster af rimelig kvalitet var dem med 6, 5, 4 eller 3 BB.

7-Statistisk analyse Hastighederne for befrugtning, spaltning, blastocystdannelse og blastocyster af høj kvalitet blev rapporteret som procenter for hver gruppe. Karakteristika for mandlige og kvindelige patienter (alder, sædtal, sædmotilitet, sædmorfologi, antal udvundne oocytter og antal modne og umodne oocytter) blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (SD). Student t-testen blev brugt til at sammenligne kontinuerte variable (befrugtningsrater, spaltning, blastocystdannelse og blastocyster af høj kvalitet). Statistisk analyse blev udført med SPSS 13.0. P-værdi ≤ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.