Resultado del uso de esperma unido a la zona pelúcida de ovocitos inmaduros para la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI)

La calidad de los espermatozoides seleccionados utilizados para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) juega un papel perjudicial en la calidad y el desarrollo embrionario. En la fertilización in vitro (FIV) y durante el viaje de los espermatozoides a través del tracto reproductivo femenino in vivo, los espermatozoides interactúan con la zona pelúcida (ZP) del ovocito, que es la última etapa de selección de espermatozoides antes de ingresar al ovocito. La ZP es selectiva con respecto a la unión y puede unirse a los espermatozoides que funcionan normalmente, especialmente aquellos con una región acrosomal normal. Según Liu et al., solo el 14 % de los espermatozoides móviles en hombres fértiles pueden unirse a la ZP. Solo aquellos espermatozoides con tamaño y forma relativamente normales de la región acrosomal y aquellos con poca o ninguna fragmentación del ácido desoxirribonucleico (ADN) pueden unirse a la ZP y fusionarse con la membrana plasmática del ovocito (oolemma) y, por lo tanto, son capaces de fertilizar el ovocito Los espermatozoides humanos varían en tamaño, morfología, integridad del ADN, motilidad, composición de la membrana, etc., y esto puede observarse incluso en el mismo eyaculado. Es un hecho que los espermatozoides en el tracto genital femenino se someten a procedimientos completos de selección de espermatozoides para filtrar los espermatozoides superiores y permitir que solo una pequeña subpoblación de espermatozoides con calidad superior llegue al sitio de fertilización donde ocurre otra selección de espermatozoides (es decir, interacción ZP).

Todavía se debaten las características del esperma que hacen que la fertilización in vitro sea efectiva. ICSI es ahora la práctica estándar para la mayoría de los centros de tecnologías de reproducción asistida (ART) en todo el mundo y representa aproximadamente el 70% de todas las fertilizaciones in vitro. La selección rutinaria de espermatozoides para ICSI depende de que un embriólogo seleccione subjetivamente los espermatozoides en función de su motilidad y morfología. Se realiza tras un análisis del líquido seminal, que es una pobre herramienta predictiva de la fertilidad masculina y no expresa la capacidad de fecundación de los espermatozoides. Había asumido que imitar la selección natural de espermatozoides podría mejorar la calidad de los espermatozoides seleccionados y, por lo tanto, los resultados clínicos de la ICSI. Idealmente, un método de selección de espermatozoides que reduce el número de espermatozoides a una subpoblación con la calidad potencialmente más alta puede mejorar la fertilización y la calidad y el desarrollo del embrión y los resultados clínicos posteriores de la ICSI.

A lo largo de los años, se han desarrollado varias técnicas de selección de espermatozoides para ICSI. Sin embargo, estas técnicas se diseñaron para seleccionar espermatozoides en función de un único parámetro espermático (es decir, motilidad, densidad, sedimentación, integridad nuclear, etc.) e ignorando otros parámetros espermáticos relacionados con la capacidad de fertilizar el ovocito. Las técnicas de selección de espermatozoides, como la centrifugación en gradiente de densidad, la microfluídica y la centrifugación en gradiente de densidad, generan una población de espermatozoides altamente móviles, pero no logran imitar la rigurosa selección natural de espermatozoides que tiene en cuenta otros parámetros espermáticos. Además, la mayoría de estos métodos requieren centrifugación, lo que puede afectar negativamente al ADN paterno y reduce la calidad del esperma al aumentar las especies reactivas de oxígeno. Siguiendo estas técnicas, un embriólogo tiene que seleccionar subjetivamente los espermatozoides en función de su motilidad y morfología, lo que no garantiza la integridad del ADN y puede llevar mucho tiempo.

Uno de los métodos de selección de espermatozoides desarrollados para duplicar relativamente la selección natural son las placas de inyección intracitoplasmática fisiológica de espermatozoides (PICSI)® basadas en la unión de ácido hialurónico (HA). La capa del cúmulo oóforo que rodea al ovocito se compone principalmente de HA. Sin embargo, hay datos contradictorios sobre los resultados utilizando platos PICSI. Además, la unión de espermatozoides-ZP comprende parámetros distintos de HA que no aparecen en las placas PICSI.

La interacción espermatozoide-ovocito es un proceso de varios pasos que involucra interacciones físicas y moleculares. Implica un proceso complejo y complementario basado en receptor/ligando entre las proteínas de superficie expresadas en la ZP y el esperma. La investigación ha revelado varios candidatos a la proteína ZP que se postula que desempeñan un papel en la unión de los espermatozoides. La proteína principal de estos es la glicoproteína 3 de la zona pelúcida (ZP3), cuyas cadenas de oligosacáridos unidos a O se unen a un espermatozoide con acrosoma intacto e inducen una reacción acrosómica.

El estudio consistió en 20 pacientes sometidos a ICSI

Nuestros criterios de inclusión incluyeron:

Edad femenina ≤ 38 años. Edad masculina ≤ 50 años. Tener al menos un ovocito inmaduro (es decir, vesícula germinal (GV) u ovocito en Metafase I (MI)) para la incubación con espermatozoides para preservar los maduros para ICSI.

Se excluyeron al menos el 10% de la motilidad de los espermatozoides y, por lo tanto, las muestras de espermatozoides testiculares. Los pacientes fueron seleccionados en base al porcentaje de fragmentación del ADN y solo se reclutaron aquellos con ≤ 20%. Los ovocitos de hermanos se dividieron aleatoriamente en un grupo de control y uno de intervención. Los ovocitos del grupo de control se inyectaron con espermatozoides seleccionados convencionalmente en función de la morfología y la motilidad de los espermatozoides. Para el grupo de intervención, se incubó un ovocito inmaduro con un volumen calculado del semen procesado con una concentración de 500 000 espermatozoides móviles/ovocito en una incubadora de dióxido de carbono (CO2) durante 10 a 30 minutos y luego se verificó el esperma unido bajo un microscopio invertido. . Solo los espermatozoides unidos con morfología normal fueron seleccionados y transferidos a una gota de polivinilpirrolidona (PVP) para inmovilización y luego inyectados en el citoplasma de los ovocitos MII de los grupos de intervención.

Manipulaciones clínicas

1. Hiperestimulación ovárica controlada (HOC): A todas las pacientes se les inyectó diariamente una hormona folículo estimulante subcutánea (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Estados Unidos de América) desde el día 3 al 5 del ciclo menstrual.

Se controló que los folículos alcanzaran el diámetro apropiado (es decir, 18-20 mm) y por su número utilizando un dispositivo de ultrasonido. Si dos o más folículos alcanzaban el diámetro adecuado, se administraba un desencadenante (gonadotropina coriónica humana (hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Suiza) por vía intramuscular para estimular la maduración final e inducir la ovulación.

2-Preparación de esperma: después de que se instruyó a las parejas masculinas a abstenerse de actividades sexuales durante 1 a 7 días, se recolectaron muestras de semen mediante masturbación. Las muestras se colocaron a temperatura ambiente en placas calientes o incubadoras a 37 ºC hasta que se licuaron y se registró el tiempo de licuefacción.

Tanto las evaluaciones macroscópicas como microscópicas se realizaron utilizando el manual de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 2010 como referencia. Luego, las muestras fueron tratadas por una de las siguientes técnicas dependiendo del factor masculino:

Para los grupos de tratamiento, se co-incubó un volumen específico del semen preparado con un ovocito inmaduro en una placa de inyección que contenía 10 µl de microgotas de medio global (LifeGlobal, Europa) con 3 ml de aceite mineral estéril equilibrado a 37 °C. con 6 % CO2 durante 10- 30 minutos. El volumen según la ecuación:

x=(volumen de gránulos x 0,5 x 100)/(motilidad x recuento (después del procesamiento)) 3-Recuperación de ovocitos: la recuperación de ovocitos se realizó aproximadamente 36 horas después de la administración del desencadenante de la ovulación. Bajo guía ecográfica, se usó una aguja de calibre de un solo lumen (Reproline, Alemania) para aspirar los folículos para una rápida recolección de ovocitos con una presión negativa de 115-120 mm Hg. Al mismo tiempo, el fluido folicular se había recogido en tubos falcon estériles de fondo redondo de 14 ml. Bajo un microscopio estereoscópico, los complejos de ovocito-cúmulo (COC) se identificaron, lavaron y transfirieron a medios totales globales de fertilización (LifeGlobal, Europa) y se incubaron con CO2 al 6 % a 37 °C hasta la denudación.

4- Denudación y puntuación de ovocitos: los AOC se denudaron colocándolos en una gota de 100 µl de medio tamponado que contenía 80 UI/ml de enzima hialuronidasa (LifeGlobal, Europa) durante 30 a 45 segundos. Luego, los ovocitos se aspiraron suavemente hacia adentro y hacia afuera con una pipeta extractora estéril, lo que resultó en la eliminación de las células coronales (25). A continuación, se utilizó un total global con tampón HEPES (LifeGlobal, Europa) para lavar los ovocitos denudados. Se utilizó un microscopio invertido equipado con manipuladores automáticos, Narishige, platina caliente y óptica Hoffman (Olympus 1x71) para evaluar la madurez de los ovocitos. La evaluación de la maduración de los ovocitos fue la siguiente: ovocitos maduros en la metafase II (MII) caracterizados por la extrusión del cuerpo polar, y ovocitos inmaduros estaban en la fase de vesícula germinal (GV) caracterizada por una vesícula germinal ubicada en el centro o en la metafase I (MI) caracterizado por la ausencia tanto del cuerpo polar como de la vesícula germinal. A continuación, los ovocitos maduros se incubaron en un medio de cultivo en una incubadora Labotect con 6% Co2 a 37 ºC hasta el momento de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Por el contrario, los ovocitos hermanos inmaduros se incubaron en un medio de cultivo (50 µ) con una concentración de espermatozoides/ovocitos de 5000 y se colocaron en la incubadora Labotect durante 10-30 minutos hasta el momento de la selección de los espermatozoides.

5- ICSI: Los ovocitos maduros se colocaron en 10 µl de microgotas del total global con tampón HEPES (LifeGlobal, Europa) cubiertas con 3 ml de aceite mineral puro equilibrado para ICSI.

En el grupo de control, a cada ovocito MII se le inyectó un espermatozoide seleccionado convencionalmente en función de la morfología y la motilidad después de ser procesado por centrifugación en gradiente de densidad (DGC). Sin embargo, en los grupos de tratamiento, los espermatozoides unidos a ZP se seleccionaron de la superficie de los ovocitos inmaduros mediante el uso de una microaguja (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, EE. UU.) y se transfirieron a una solución de polivinilpirrolidona (PVP) al 10 % (SAGE, UU.), inmovilizados y luego utilizados para inyectar ovocitos hermanos MII. El procedimiento se llevó a cabo bajo un microscopio invertido equipado con una pipeta de sujeción con ligera presión negativa para manipular el ovocito y una aguja de inyección para inyectar el espermatozoide. Los ovocitos inmaduros utilizados para la selección de espermatozoides fueron descartados. En todos los grupos, la aguja de inyección que contenía un único espermatozoide se movió de forma constante y lenta a través del citoplasma del ovocito MII y dejó caer de 1 a 3 µl hasta el centro del ovocito.

6- Medidas de resultado: Todos los parámetros embriológicos (es decir, fertilización, escisión, formación de blastocistos y calidad de blastocistos) fueron registrados y evaluados. Se observaron signos de fertilización 16-18 horas después de la ICSI. Además, 48 ​​y 72 h después de ICSI, se evaluó la tasa de clivaje. La tasa de formación de blastocistos se evaluó el día cinco después de la ICSI. Los embriones con formación de blastocistos de alta calidad se clasificaron según el sistema de clasificación de blastocistos de Gardner. Este sistema asigna grados de expansión y estado de eclosión según la masa celular interna (ICM) y la calidad del trofectodermo (TE). Los blastocistos de buena calidad se clasificaron como aquellos con 6, 5, 4 o 3AA, AB o BA. Los blastocistos de buena calidad fueron aquellos con 6, 5, 4 o 3 BB.

7-Análisis estadístico Las tasas de fertilización, escisión, formación de blastocistos y blastocistos de alta calidad se informaron como porcentajes para cada grupo. Las características de los pacientes masculinos y femeninos (edad, recuento de espermatozoides, motilidad de los espermatozoides, morfología de los espermatozoides, número de ovocitos recuperados y número de ovocitos maduros e inmaduros) se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Se empleó la prueba t de Student para comparar variables continuas (tasas de fertilización, escisión, formación de blastocistos y blastocistos de alta calidad). El análisis estadístico se realizó con SPSS 13.0. El valor de p ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativo.