Az éretlen petesejt zónájához kötött spermiumok intracitoplazmatikus spermainjekcióhoz (ICSI) való felhasználásának eredménye

Az intracitoplazmatikus spermiuminjekcióhoz (ICSI) használt kiválasztott spermiumok minősége káros szerepet játszik az embrionális minőségben és fejlődésben. Az in vitro megtermékenyítés (IVF) és a spermiumok in vivo a női reproduktív traktuson keresztüli utazása során a spermiumok kölcsönhatásba lépnek a petesejtek zona pellucida-jával (ZP), ami a spermiumok szelekciójának utolsó szakasza a petesejtekbe való belépés előtt. A ZP szelektív a kötődés szempontjából, és képes kötődni a normálisan működő spermiumokhoz, különösen azokhoz, amelyek normális akroszómális régióval rendelkeznek. Liu és munkatársai szerint a termékeny férfiakban a mozgékony spermiumok mindössze 14%-a tud kötődni a ZP-hez. Csak azok a spermiumok, amelyeknek az akroszóma régiója viszonylag normális méretű és alakú, valamint azok, amelyekben nincs vagy alacsony a dezoxiribonukleinsav (DNS) fragmentációja, képesek kötődni a ZP-hez és egyesülni a petesejtek plazmamembránjához (oolemma), és így képesek megtermékenyíteni petesejt. Az emberi spermiumok mérete, morfológiája, DNS integritása, mozgékonysága, membránösszetétele stb. különbözik, és ez még egyazon ejakulátumban is megfigyelhető. Tény, hogy a női nemi traktusban alapos spermium-szelekciós eljárások érik a spermiumokat a kiváló spermiumok kiszűrése érdekében, és csak a kiváló minőségű spermiumok kis szubpopulációja éri el a megtermékenyítés helyét, ahol egy másik spermium szelekció történik (pl. ZP interakció).

A spermiumok azon tulajdonságairól, amelyek az in vitro megtermékenyítést hatékonysá teszik, még mindig vitatott. Az ICSI ma már a legtöbb asszisztált reprodukciós technológiai (ART) központban bevett gyakorlat világszerte, és az összes in vitro megtermékenyítés körülbelül 70%-át teszi ki. A spermiumok rutin szelekciója az ICSI-hez attól függ, hogy az embriológus szubjektíven választja ki a spermiumokat motilitásuk és morfológiájuk alapján. Az ondófolyadék elemzése után történik, amely a férfi termékenység rossz előrejelző eszköze, és nem fejezi ki a spermium megtermékenyítő képességét. Feltételezték, hogy a természetes spermiumszelekció utánzása javíthatja a kiválasztott spermiumok minőségét, és ezáltal az ICSI klinikai kimenetelét. Ideális esetben egy olyan spermium-szelekciós módszer, amely a spermiumok számát potenciálisan a legjobb minőségű szubpopulációra csökkenti, javíthatja a megtermékenyítést, az embrió minőségét és fejlődését, valamint az ICSI későbbi klinikai eredményeit.

Az évek során számos sperma szelekciós technikát fejlesztettek ki az ICSI számára. Ezeket a technikákat azonban úgy tervezték, hogy egyetlen spermaparaméter alapján szelektáljanak a spermiumot (pl. motilitás, sűrűség, szedimentáció, nukleáris integritás stb.) és figyelmen kívül hagyva a petesejt megtermékenyítési képességével kapcsolatos egyéb spermaparamétereket. A spermiumok szelekciós technikái, mint például a felúszás, a mikrofluidika és a sűrűséggradiens centrifugálás rendkívül mozgékony spermiumpopulációt eredményeznek, de nem utánozzák a szigorú természetes spermium-szelekciót, amely figyelembe veszi az egyéb spermaparamétereket. Ezen túlmenően a legtöbb ilyen módszer centrifugálást igényel, ami negatívan befolyásolhatja az apai DNS-t, és csökkenti a spermiumok minőségét a reaktív oxigénfajták növekedésével. Ezeket a technikákat követve az embriológusnak szubjektíven kell kiválasztania a spermiumokat motilitásuk és morfológiájuk alapján, ami nem garantálja a DNS integritását, és potenciálisan időigényes.

Az egyik kifejlesztett sperma szelekciós módszer a természetes szelekció viszonylagos megkettőzésére a hialuronsav (HA) kötésen alapuló fiziológiás intracitoplazmatikus spermium injekció (PICSI)® edények. A petesejteket körülvevő cumulus oophorus réteg főleg HA-ból áll. Azonban ellentmondó adatok állnak rendelkezésre a PICSI edények használatával elért eredményekről. Ezenkívül a spermium-ZP kötődés a HA-n kívül más paramétereket is tartalmaz, amelyek nem szerepelnek a PICSI edényekben.

A spermium-petesejtek kölcsönhatása egy többlépcsős folyamat, amely fizikai és molekuláris kölcsönhatásokat foglal magában. Ez egy komplex és komplementer receptor/ligandum alapú folyamatot foglal magában a ZP-n expresszált felszíni fehérjék és a spermium között. A kutatások számos olyan ZP fehérje jelöltet tártak fel, amelyekről feltételezték, hogy szerepet játszanak a spermiumok megkötésében. Ezek fő fehérje a zona pellucida glikoprotein 3 (ZP3), amelynek O-kapcsolt oligoszacharid láncai egy akroszómával ép spermiumhoz kötődnek, és akroszómális reakciót váltanak ki.

A vizsgálatban 20 ICSI-n átesett beteg vett részt

Bevételi kritériumaink a következők voltak:

Nő életkora ≤ 38 év. Férfi életkor ≤ 50 év. Legalább egy éretlen petesejttel rendelkezik (pl. csíravezikula (GV) vagy metafázis I (MI) petesejtek) spermiumokkal való inkubációhoz, hogy megőrizzék az éretteket az ICSI számára.

A spermiumok mozgékonyságának legalább 10%-át, így a herék spermiummintáit kizártuk. A betegeket a DNS fragmentáció százalékos aránya alapján választottuk ki, és csak azokat vettük fel, akiknél ≤ 20% volt. A testvér petesejteket véletlenszerűen kontroll és intervenciós csoportra osztottuk. A kontrollcsoport petesejteket a spermiumok morfológiája és motilitása alapján hagyományosan kiválasztott spermiumokkal injektáltuk. Az intervenciós csoportban egy éretlen petesejteket inkubáltunk a feldolgozott sperma számított térfogatával 500 000 mozgékony spermium/petesejtek koncentrációjával szén-dioxid (CO2) inkubátorban 10-30 percig, majd fordított mikroszkóp alatt ellenőriztük a megkötött spermiumok jelenlétét. . Csak a kötött, normál morfológiájú spermiumokat választottuk ki, és egy polivinilpirrolidon (PVP) cseppbe vittük át immobilizálás céljából, majd injektáltuk az intervenciós csoportok MII oocitáinak citoplazmájába.

Klinikai manipulációk

1. Kontrollált petefészek hiperstimuláció (COH): Minden nőbetegnek naponta szubkután tüszőstimuláló hormont (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Amerikai Egyesült Államok) injekcióztak a menstruációs ciklus 3. és 5. napjától.

Ellenőriztük, hogy a tüszők elérték-e a megfelelő átmérőt (pl. 18-20 mm) és számukra ultrahang készülékkel. Ha két vagy több tüsző elérte a megfelelő átmérőt, egy triggert (humán chorion gonadotropin (hCG)) (Ovitrelle®; Merck Serono, Svájc) adtak be intramuszkulárisan, hogy ösztönözzék a végső érést és indukálják az ovulációt.

2-sperma előkészítése: Miután a férfi párokat arra utasították, hogy 1-7 napig tartózkodjanak a szexuális tevékenységtől, ondómintákat vettünk maszturbációval. A mintákat szobahőmérsékleten meleg lemezekre vagy 37 °C-os inkubátorokra helyeztük, amíg elfolyósodtak, és feljegyeztük a cseppfolyósítás idejét.

Mind a makroszkópos, mind a mikroszkópos értékeléseket az Egészségügyi Világszervezet (WHO) 2010-es kézikönyve alapján végezték referenciaként. Ezután a mintákat a férfitényezőtől függően a következő technikák egyikével kezelték:

A kezelt csoportok esetében az előkészített sperma meghatározott térfogatát éretlen petesejttel együtt inkubáltuk egy injekciós csészében, amely 10 µl mikrocsepp globális tápközeget (LifeGlobal, Európa) tartalmazott 3 ml steril, egyensúlyozott ásványolajjal 37 °C-on. 6% CO2-vel 10-30 percig. A térfogat az egyenlet szerint:

x=(pellettérfogat x 0,5 x 100)/(motilitás x szám (feldolgozás után)) 3-Oocita visszanyerés: A petesejtek visszanyerése körülbelül 36 órával az ovulációs trigger beadása után történt. Ultrahangos irányítás mellett egyetlen lumenmérő tűt (Reproline, Németország) használtak a tüszők leszívására, hogy 115-120 Hgmm negatív nyomás mellett gyors petesejt-felvételt kapjanak. Ezzel egyidejűleg a follikuláris folyadékot gömbölyű fenekű steril, 14 ml-es sólyomcsövekbe gyűjtöttük. Sztereo mikroszkóp alatt azonosítottuk a petesejtek kumulusz komplexeit (COC), megmostuk, megtermékenyítő globális össztápközegbe (LifeGlobal, Europe) vitték át, és 6%-os CO2 mellett 37°C-on a denudációig inkubálták.

4. Petesejtek denudációja és pontozása: A COC-okat denudáltuk úgy, hogy 100 µ1 csepp pufferolt tápközegbe helyeztük őket, amely 80 NE/ml hialuronidáz enzimet tartalmazott (LifeGlobal, Európa) 30-45 másodpercre. Ezután a petesejteket egy steril sztripper pipettával óvatosan be- és kiszívtuk, ami a koronasejtek eltávolítását eredményezte (25). Ezt követően globális teljes HEPES puffert (LifeGlobal, Európa) használtunk a denudált petesejtek mosására. A petesejtek érettségének felmérésére automata manipulátorral, Narishige-vel, hot-stadiummal és Hoffman optikával (Olympus 1x71) felszerelt fordított mikroszkópot használtunk. A petesejtek érésének értékelése a következő volt: az érett petesejtek a II. metafázisban (MII), amelyet a poláris test extrudálása jellemez, és az éretlen petesejtek vagy a germinális vezikulum fázisban (GV), amelyet egy központilag elhelyezkedő csíravezikula jellemez, vagy a metafázisban. I (MI), amelyet a poláris test és a csíravezikula hiánya jellemez. Az érett petesejteket ezután Labotect inkubátorban 6% Co2-ot tartalmazó tenyésztő tápközegben 37 ºC-on inkubáltuk az intracitoplazmatikus spermiuminjekció időpontjáig. Ezzel szemben a testvérek éretlen petesejteket tenyésztő tápközegben (50 µ) inkubáltuk 5000 koncentrációjú spermium/petesejtek között, és a Labotect inkubátorba helyeztük 10-30 percre a spermiumszelekció időpontjáig.

5- ICSI: Az érett petesejteket 10 µl mikrocseppekbe helyeztük a globális teljes w/HEPES pufferből (LifeGlobal, Európa), amelyet 3 ml tiszta, egyensúlyozott ásványolajjal borítottunk az ICSI-hez.

A kontrollcsoportban minden MII petesejteket a morfológia és a mozgékonyság alapján hagyományosan kiválasztott spermával fecskendeztek be, miután sűrűséggradiens centrifugálással (DGC) feldolgozták. A kezelt csoportokban azonban a ZP-hez kötött spermiumokat az éretlen petesejtek felszínéről választották ki mikrotű segítségével (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA), és 10%-os polivinilpirrolidon (PVP) oldatba (SAGE, USA), immobilizáltuk, majd testvér MII petesejtek injektálására használták. Az eljárást fordított mikroszkóp alatt végeztük, amely enyhe negatív nyomású tartópipettával volt ellátva a petesejtek kezelésére és injekciós tűvel a spermiumok befecskendezésére. A spermiumszelekcióhoz használt éretlen petesejteket eldobtuk. Az összes csoportban az egyetlen spermiumot tartalmazó injekciós tűt folyamatosan és lassan mozgatták át a MII oocita citoplazmáján, és 1-3 µl-rel a petesejtek közepére engedték.

6. Eredménymérők: Az összes embriológiai paraméter (pl. a megtermékenyítés, a hasítás, a blasztociszta képződés és a blasztociszta minősége) rögzítettük és értékeltük. A megtermékenyítés jeleit az ICSI után 16-18 órával észlelték. Ezenkívül 48 és 72 órával az ICSI után értékeltük a hasítási sebességet. A blasztociszta képződési sebességet az ICSI utáni ötödik napon értékeltük. A jó minőségű blasztocisztaképződéssel rendelkező embriókat a Gardner-féle blasztociszta osztályozási rendszer szerint osztályozták. Ez a rendszer a belső sejttömeg (ICM) és a trofektoderma (TE) minősége szerint osztja ki a tágulási és kelési állapotot. A jó minőségű blasztocisztákat a 6, 5, 4 vagy 3AA, AB vagy BA értékűek közé sorolták. A megfelelő minőségű blasztociszták 6, 5, 4 vagy 3 BB-vel rendelkeztek.

7. Statisztikai elemzés A megtermékenyítés, a hasadás, a blasztociszta képződés és a jó minőségű blasztociszták arányát százalékos arányban jelentették minden csoportra vonatkozóan. A férfi és női betegek jellemzőit (életkor, spermiumok száma, spermiumok motilitása, spermiumok morfológiája, kinyert petesejtek száma, érett és éretlen petesejtek száma) átlag ± standard deviáció (SD) értékben fejeztük ki. A Student t-tesztet a folytonos változók (megtermékenyítési arányok, hasadás, blasztociszta képződés és jó minőségű blasztociszták) összehasonlítására alkalmaztuk. A statisztikai elemzést az SPSS 13.0 programmal végeztük. A ≤ 0,05 P-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.