Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI)을 위해 미성숙 난모세포의 Zona Pellucida에 결합된 정자를 사용한 결과

세포질 내 정자 주입(ICSI)에 사용되는 선택된 정자의 품질은 배아의 품질과 발달에 해로운 역할을 합니다. 체외 수정(IVF) 및 생체 내 여성 생식관을 통한 정자의 이동 중에 정자는 난모세포에 들어가기 전 정자 선택의 마지막 단계인 난모세포의 투명대(ZP)와 상호 작용합니다. ZP는 결합과 관련하여 선택적이며 정상적으로 기능하는 정자, 특히 정상 첨체 영역을 가진 정자에 결합할 수 있습니다. Liu 등에 따르면 가임 남성의 운동성 정자 중 14%만이 ZP에 결합할 수 있습니다. 첨체 부위의 크기와 모양이 비교적 정상인 정자와 데옥시리보핵산(DNA) 단편화가 없거나 낮은 정자만이 ZP에 결합하여 난모세포의 원형질막(oolemma)과 융합할 수 있으므로 수정이 가능합니다. 난자 인간의 정자는 크기, 형태, DNA 무결성, 운동성, 막 구성 등이 다양하며 이는 동일한 사정에서도 관찰될 수 있습니다. 철저한 정자 선택 절차는 우수한 정자를 걸러내고 다른 정자 선택이 일어나는 수정 부위(즉, ZP 상호 작용).

체외 수정을 효과적으로 만드는 정자의 특성에 대해서는 여전히 논쟁의 여지가 있습니다. ICSI는 현재 전 세계 대부분의 보조 생식 기술(ART) 센터의 표준 관행이며 모든 체외 수정의 약 70%를 차지합니다. ICSI를 위한 정자의 일상적인 선택은 운동성과 형태에 따라 정자를 주관적으로 선택하는 배아학자에 달려 있습니다. 그것은 남성 생식력의 빈약한 예측 도구이며 정자의 수정 능력을 나타내지 않는 정액의 분석 후에 행해집니다. 자연 정자 선택을 모방하면 선택된 정자의 질이 향상되어 ICSI의 임상 결과가 향상될 수 있다고 가정했습니다. 이상적으로는 정자 수를 잠재적으로 가장 높은 품질을 가진 하위 집단으로 줄이는 정자 선택 방법은 수정 및 배아 품질과 발달 및 ICSI의 후속 임상 결과를 향상시킬 수 있습니다.

수년에 걸쳐 ICSI를 위해 몇 가지 정자 선택 기술이 개발되었습니다. 그러나 이러한 기술은 단일 정자 매개변수(즉, 운동성, 밀도, 침강, 핵 무결성 등) 및 난모세포를 수정하는 능력과 관련된 다른 정자 매개변수를 무시합니다. 스윔업, 미세 유체 공학 및 밀도 구배 원심분리와 같은 정자 선택 기술은 운동성이 높은 정자 집단을 산출하지만 다른 정자 매개변수를 고려하는 엄격한 자연 정자 선택을 모방하지 못합니다. 더욱이 이러한 방법의 대부분은 부계 DNA에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 원심분리를 필요로 하며 활성 산소 종을 증가시켜 정자의 질을 저하시킵니다. 이러한 기술에 따라 발생학자는 운동성과 형태에 따라 정자를 주관적으로 선택해야 하며, 이는 DNA 무결성을 보장하지 않으며 잠재적으로 시간이 많이 소요됩니다.

상대적으로 자연 선택을 복제하기 위해 개발된 정자 선택 방법 중 하나는 히알루론산(HA) 결합 기반의 Physiological intracytoplasmic sperm injection(PICSI)® 접시입니다. 난모세포를 둘러싼 난구층은 주로 HA로 구성됩니다. 그러나 PICSI 요리를 사용한 결과에 대해 상충되는 데이터가 있습니다. 더욱이 정자-ZP 결합은 PICSI 요리에 포함되지 않은 HA 이외의 매개변수를 포함합니다.

정자-난모세포 상호작용은 물리적 및 분자적 상호작용을 포함하는 다단계 과정입니다. 그것은 ZP와 정자에서 발현되는 표면 단백질 사이의 복잡하고 보완적인 수용체/리간드 기반 프로세스를 포함합니다. 연구에서는 정자를 결합시키는 역할을 하는 것으로 추정되는 여러 ZP 단백질 후보를 공개했습니다. 이들의 주요 단백질은 ZP3(zona pellucida glycoprotein 3)으로, O-연결된 올리고당 사슬이 첨체 온전한 정자에 결합하여 첨체 반응을 유도합니다.

이 연구는 ICSI를 겪고 있는 20명의 환자로 구성되었습니다.

포함 기준은 다음과 같습니다.

여성 연령 ≤ 38세. 남성 나이 ≤ 50세. 적어도 하나의 미성숙 난모세포(즉, 생식소포(GV) 또는 중기 I(MI) 난모세포)를 정자와 함께 배양하여 ICSI에 대한 성숙한 정자를 보존합니다.

적어도 10%의 정자 운동성 및 따라서 고환 정자 샘플은 제외되었습니다. DNA 단편화 비율에 따라 환자를 선택하고 20% 이하인 환자만 모집했습니다. 형제 난모세포는 무작위로 대조군과 개입군으로 나누었습니다. 대조군의 난모세포에는 정자의 형태와 운동성에 기초하여 통상적으로 선별된 정자를 주입하였다. 개입군은 미성숙 난자 1개를 이산화탄소(CO2) 배양기에서 500,000개의 운동성 정자/난자 농도로 계산된 부피의 처리된 정액과 함께 10~30분 동안 배양한 후 도립현미경으로 결합된 정자를 확인했습니다. . 정상적인 형태의 결합된 정자만 선택하여 고정화를 위해 PVP(Polyvinylpyrrolidone) 드롭으로 옮긴 다음 개입 그룹의 MII 난모세포의 세포질에 주입했습니다.

임상 조작

1. Controlled ovarian hyperstimulation (COH): 모든 여성 환자에게 월경주기 3일에서 5일까지 매일 피하 난포 자극 호르몬(Gn, Gonal-F, Merck Serono, United States of America)을 주사했습니다.

모낭이 적절한 직경(즉, 18-20mm) 및 초음파 장치를 사용하여 번호를 지정합니다. 2개 이상의 난포가 적절한 직경에 도달하면 트리거(인간 융모막 성선 자극 호르몬(hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Switzerland)를 근육 내 투여하여 최종 성숙을 촉진하고 배란을 유도했습니다.

2-정자 준비: 남성 커플에게 1일에서 7일 동안 성행위를 삼가도록 지시한 후 자위를 통해 정액 샘플을 채취했습니다. 샘플은 액화될 때까지 37ºc의 따뜻한 플레이트 또는 인큐베이터에 실온에 놓고 액화 시간을 기록했습니다.

2010년 세계보건기구(WHO) 매뉴얼을 참조하여 거시적 평가와 미시적 평가를 모두 수행했습니다. 그런 다음 남성 요인에 따라 다음 기술 중 하나로 샘플을 처리했습니다.

처리 그룹의 경우, 준비된 정액의 특정 부피를 37°C에서 3ml의 멸균 평형 미네랄 오일 오버레이와 함께 10μl 마이크로 방울의 글로벌 배지(LifeGlobal, 유럽)가 들어 있는 주사 접시에서 미성숙 난모세포와 공동 배양했습니다. 10-30분 동안 6% CO2로. 방정식에 따른 부피:

x=(펠릿 부피 x 0.5 x 100)/(운동성 x 계수(처리 후)) 3-난자 회수: 난자 회수는 배란 촉진제 투여 후 약 36시간 후에 수행되었습니다. 초음파 안내 하에서 단일 루멘 게이지 바늘(Reproline, 독일)을 사용하여 115-120mmHg의 음압으로 빠른 난자 픽업을 위해 난포를 흡인했습니다. 동시에, 난포액은 둥근 바닥 멸균 14ml 팔콘 튜브에 수집되었습니다. 입체현미경 하에서 난모세포-난구 복합체(COC)를 확인하고 세척한 후 비료화 글로벌 총배지(LifeGlobal, Europe)로 옮기고 37°C에서 6% CO2에서 벗겨낼 때까지 배양했습니다.

4- 난모세포 박리 및 채점: COC를 히알루로니다아제 효소 80 IU/ml(LifeGlobal, 유럽)가 포함된 완충 배지 100µ1 방울에 30~45초 동안 넣어 박리했습니다. 그런 다음 멸균 스트리퍼 피펫으로 난모세포를 부드럽게 흡인하여 관상 세포를 제거했습니다(25). 그 후, 벗겨진 난모세포를 세척하기 위해 global total w/HEPES Buffer(LifeGlobal, Europe)를 사용했습니다. 자동 조작기가 장착된 도립현미경, Narishige, hot stage, Hoffman optics(Olympus 1x71)를 사용하여 난모세포의 성숙도를 평가하였다. 난모세포 성숙 평가는 다음과 같다: 극체의 돌출을 특징으로 하는 중기 II(MII)의 성숙 난모세포 및 미성숙 난모세포는 중앙에 위치한 배아낭을 특징으로 하는 배낭기(GV) 또는 중기에 있었다. I(MI)는 극체와 배낭이 모두 없는 것이 특징입니다. 그런 다음 성숙한 난모세포를 세포질 내 정자 주입 시점까지 37ºC에서 6% Co2가 있는 Labotect 인큐베이터의 배양 배지에서 배양했습니다. 반면, 형제 미성숙 난모세포는 정자/난모세포 농도가 5000인 배지(50 μ)에서 배양한 후 정자 선별 시점까지 10-30분 동안 Labotect 배양기에 넣어두었다.

5- ICSI: 성숙한 난모세포를 ICSI용 순수 평형 미네랄 오일 3ml로 덮인 HEPES 완충액(LifeGlobal, 유럽)이 포함된 글로벌 토탈 10µl 마이크로 방울에 넣었습니다.

대조군에서는 각각의 MII 난모세포에 밀도구배원심분리(DGC)로 처리한 후 형태와 운동성을 기준으로 통상적으로 선별된 정자를 주입하였다. 그러나 처리군에서는 미세바늘(Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA)을 이용하여 미성숙 난모세포의 표면에서 ZP가 결합된 정자를 선별하여 10% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 용액(SAGE, USA), 고정화한 다음 형제 MII 난모세포를 주입하는 데 사용합니다. 절차는 난모세포를 다루기 위한 약간의 음압을 가진 홀딩 피펫과 정자를 주입하기 위한 주입 바늘이 장착된 도립 현미경 하에서 수행되었습니다. 정자 선택에 사용된 미성숙 난모세포는 폐기되었습니다. 모든 그룹에서 단일 정자가 포함된 주사바늘은 MII 난모세포의 세포질을 천천히 천천히 이동하면서 난모세포 중심으로 1~3μl 떨어졌다.

6- 결과 측정: 모든 배아학적 매개변수(즉, 수정, 분열, 배반포 형성 및 배반포 품질)을 기록하고 평가했습니다. 수정 징후는 ICSI 16-18시간 후에 관찰되었습니다. 또한, ICSI 48시간 및 72시간 후 절단율을 평가하였다. 배반포 형성 속도는 ICSI 후 5일째에 평가되었습니다. 고품질 배반포 형성을 가진 배아는 Gardner의 배반포 등급 시스템에 따라 분류되었습니다. 이 시스템은 내부 세포 덩어리(ICM) 및 영양외배엽(TE) 품질에 따라 확장 및 부화 상태 등급을 지정합니다. 양질의 배반포는 6, 5, 4 또는 3AA, AB 또는 BA로 분류되었습니다. 공정한 품질의 배반포는 6, 5, 4 또는 3 BB를 가진 배반포였습니다.

7-통계학적 분석 수정율, 분열율, 배반포 형성율, 고품질 배반포율을 각 군별로 백분율로 보고하였다. 남녀 환자의 특성(연령, 정자 수, 정자 운동성, 정자 형태, 회수된 난자 수, 성숙 및 미성숙 난자 수)은 평균±표준편차(SD)로 표현하였다. 연속 변수(수정률, 분열, 배반포 형성 및 고품질 배반포)를 비교하기 위해 Student t-test를 사용했습니다. 통계분석은 SPSS 13.0으로 수행하였다. P-값 ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.