未熟卵母細胞の透明帯に結合した精子を細胞質内精子注入（ICSI）に使用した結果

細胞質内精子注入 (ICSI) に使用される選択された精子の品質は、胚の品質と発育に悪影響を及ぼします。 体外受精 (IVF) および生体内での女性の生殖管を通る精子の移動中に、精子は卵母細胞の透明帯 (ZP) と相互作用します。これは、卵母細胞に入る前の精子選択の最終段階です。 ZP は結合に関して選択的であり、正常に機能している精子、特に正常な先体領域を持つ精子に結合できます。 Liu らによると、妊娠可能な男性の運動精子の 14 % だけが ZP に結合することができます。 先体領域の比較的正常なサイズと形状を持つ精子、およびデオキシリボ核酸 (DNA) 断片化がないか、または断片化が少ない精子だけが、ZP に結合し、卵母細胞の原形質膜 (卵細胞膜) と融合することができ、したがって受精することができます。卵母細胞。 人間の精子はサイズ、形態、DNA の完全性、運動性、膜の組成などが異なり、同じ射精液であってもそれが観察されます。 女性生殖管内の精子には徹底的な精子選択手順が課せられ、優れた精子が濾過され、優れた品質を持つ少数の精子のみが受精部位に到達し、そこで別の精子の選択が行われることは明らかな事実です。 ZP インタラクション)。

体外受精を効果的にする精子の形質については、まだ議論が続いている。 ICSI は現在、世界中のほとんどの生殖補助医療 (ART) センターで標準的な実施となっており、体外受精全体の約 70% を占めています。 ICSI 用の精子の日常的な選択は、発生学者が運動性と形態に基づいて主観的に精子を選択することに依存します。 これは精液の分析後に行われますが、これは男性の生殖能力を予測するツールとしては不十分であり、精子の受精能力を表すものではありません。 自然の精子選択を模倣することで、選択された精子の品質が向上し、したがってICSIの臨床転帰が向上する可能性があると考えられていました。 理想的には、精子の数を潜在的に最高の品質を持つ部分集団に減らす精子選択法は、受精、胚の品質、発育、そしてその後の ICSI の臨床転帰を改善することができます。

長年にわたり、ICSI 用にいくつかの精子選択技術が開発されてきました。 ただし、これらの技術は、単一の精子パラメーター (つまり、 運動性、密度、沈降、核の完全性など）、卵母細胞の受精能力に関連する他の精子パラメーターは無視されます。 スイムアップ、マイクロ流体工学、密度勾配遠心分離などの精子選択技術では、運動性の高い精子の集団が得られますが、他の精子パラメータを考慮した厳密な自然精子選択を模倣することはできません。 さらに、これらの方法のほとんどは遠心分離を必要とするため、父方の DNA に悪影響を及ぼし、活性酸素種が増加して精子の品質が低下する可能性があります。 これらの技術に従って、発生学者は運動性と形態に基づいて主観的に精子を選択する必要がありますが、これでは DNA の完全性が保証されず、時間がかかる可能性があります。

自然選択を比較的再現するために開発された精子選択法の 1 つは、ヒアルロン酸 (HA) 結合に基づく生理学的細胞質内精子注入 (PICSI)® ディッシュです。 卵母細胞を取り囲む卵丘層は主に HA で構成されています。 ただし、PICSI ディッシュを使用した結果については矛盾するデータがあります。 さらに、精子と ZP の結合には、PICSI ディッシュには記載されていない HA 以外のパラメーターが含まれています。

精子と卵母細胞の相互作用は、物理的および分子的相互作用を伴う多段階のプロセスです。 これには、ZP 上で発現される表面タンパク質と精子の間の複雑で相補的な受容体/リガンドに基づくプロセスが関与します。 研究により、精子の結合に役割を果たすと想定されるいくつかのZPタンパク質候補が明らかになった。 これらの主なタンパク質は透明帯糖タンパク質 3 (ZP3) であり、その O 結合型オリゴ糖鎖が先体を保持した精子に結合し、先体反応を誘導します。

この研究はICSIを受けている20人の患者で構成されていました

採用基準には次のものが含まれます。

女性の年齢は38歳以下。 男性の年齢は50歳以下。 少なくとも 1 つの未熟な卵母細胞を持っている（すなわち、 胚胞 (GV) または中期 I (MI) 卵母細胞) を精子とインキュベートし、ICSI 用に成熟卵母細胞を保存します。

少なくとも 10% の精子運動性、したがって精巣精子サンプルは除外されました。 患者は DNA 断片化の割合に基づいて選択され、20% 以下の患者のみが採用されました。 兄弟卵母細胞をランダムに対照群と介入群に分けました。 対照群の卵母細胞には、精子の形態と運動性に基づいて従来通りに選択された精子が注入されました。 介入群では、1 個の未熟卵母細胞を、二酸化炭素 (CO2) インキュベーター内で 500,000 個の運動精子/卵母細胞の濃度で計算した量の処理された精液と 10 ～ 30 分間インキュベートし、その後、倒立顕微鏡で結合精子を確認しました。 。 正常な形態を有する結合精子のみが選択され、固定化のためにポリビニルピロリドン (PVP) ドロップに移され、介入グループの MII 卵母細胞の細胞質に注入されました。

臨床操作

1. 制御された卵巣過剰刺激 (COH): すべての女性患者に、月経周期の 3 日目から 5 日目まで卵胞刺激ホルモン (Gn、Gonal-F、Merck Serono、米国) を毎日皮下注射しました。

卵胞が適切な直径に達しているかどうかをチェックしました（つまり、 18-20 mm）および超音波装置を使用してその数を調べます。 2つ以上の卵胞が適切な直径に達した場合、最終的な成熟を促進し、排卵を誘発するために、トリガー（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG））（Ovitrelle®、Merck Serono、スイス）を筋肉内投与しました。

2-精子の準備: 男性カップルに 1 ～ 7 日間性行為を控えるよう指示した後、マスターベーションによって精液サンプルを収集しました。 サンプルは、液化するまで室温で温かいプレートまたは 37℃ のインキュベーター上に置き、液化時間を記録しました。

巨視的評価と微視的評価は両方とも、2010 年の世界保健機関 (WHO) マニュアルを参照として使用して実行されました。 次に、男性因子に応じて、次のいずれかの手法でサンプルを処理しました。

治療群では、37℃で3mlの滅菌平衡化ミネラルオイルオーバーレイを含む10μlのマイクロドロップのグローバル培地（LifeGlobal、ヨーロッパ）を含む注入皿中で、特定の量の調製した精液を未熟卵母細胞と共インキュベートしました。 6 % CO2 で 10 ～ 30 分間。 次の方程式による体積:

ｘ＝（ペレット体積×０．５×１００）／（運動性×数（処理後）） ３−採卵：排卵誘発剤の投与から約３６時間後に採卵を行った。 超音波誘導下で、シングルルーメンゲージ針 (Reproline、ドイツ) を使用して、115 ～ 120 mm Hg の陰圧で卵母細胞を迅速にピックアップするために卵胞を吸引しました。 同時に、卵胞液を丸底滅菌 14 ml ファルコンチューブに収集しました。 実体顕微鏡下で、卵母細胞卵丘複合体 (COC) を同定、洗浄し、受精グローバルトータル培地 (LifeGlobal、ヨーロッパ) に移し、裸化するまで 6% CO2、37°C​​ でインキュベートしました。

4- 卵母細胞の露出およびスコアリング: COC を、ヒアルロニダーゼ酵素 80 IU/ml (LifeGlobal、ヨーロッパ) を含む緩衝培地の 100 μ1 滴に 30 ～ 45 秒間置くことによって露出させました。 次に、卵母細胞を滅菌ストリッパーピペットで優しく吸引し、その結果、冠状細胞が除去されました (25)。 その後、HEPES バッファー (LifeGlobal、ヨーロッパ) を含むグローバル トータルを使用して、露出した卵母細胞を洗浄しました。 自動マニピュレーター、Narishige、ホットステージ、およびホフマン光学系 (Olympus 1x71) を備えた倒立顕微鏡を、卵母細胞の成熟度の評価に使用しました。 卵母細胞の成熟評価は以下の通りであった：成熟卵母細胞は極体の突出を特徴とする中期II（MII）にあり、未熟卵母細胞は中央に位置する胚胞を特徴とする胚胞期（GV）または中期のいずれかにあった。 I (MI) は、極体と胚胞の両方が存在しないことを特徴とします。 次に、成熟卵母細胞を、細胞質内精子注入時まで、37℃、6% CO2を含むLabotectインキュベーター内の培地中でインキュベートしました。 対照的に、兄弟の未熟卵母細胞は、5000 濃度の精子/卵母細胞を含む培地 (50 μ) でインキュベートされ、精子選択の時まで 10 ～ 30 分間、Labotect インキュベーター内に置かれました。

5- ICSI: 成熟卵母細胞を、ICSI 用の純粋な平衡化ミネラルオイル 3 ml で覆われた HEPES バッファー (LifeGlobal、ヨーロッパ) を含むグローバルトータル液 10 μl のマイクロドロップ中に入れました。

対照群では、各 MII 卵母細胞に、密度勾配遠心分離 (DGC) で処理した後、形態と運動性に基づいて従来どおりに選択した精子を注入しました。 ただし、治療群では、マイクロニードル (Sunlight Medical、フロリダ州ジャクソンビル、米国) を使用して未熟卵母細胞の表面から ZP 結合精子を選択し、10% ポリビニルピロリドン (PVP) 溶液 (SAGE、米国）、固定化され、兄弟 MII 卵母細胞の注入に使用されます。 この手順は、卵母細胞を扱うためのわずかな負圧を備えた保持ピペットと精子を注入するための注射針を備えた倒立顕微鏡下で実行されました。 精子の選択に使用した未熟卵母細胞は廃棄しました。 すべてのグループにおいて、単一の精子を含む注射針は、MII 卵母細胞の細胞質を通って着実かつゆっくりと移動し、卵母細胞の中心に 1 ～ 3 μl 滴下されました。

6- 結果の尺度: すべての発生学的パラメーター (すなわち、 受精、卵割、胚盤胞形成、および胚盤胞の品質）を記録し、評価しました。 受精の兆候は、ICSI の 16 ～ 18 時間後に観察されました。 さらに、ICSI の 48 時間後および 72 時間後に、切断率を評価しました。 胚盤胞形成率は、ICSI 後 5 日目に評価されました。 高品質の胚盤胞形成を有する胚は、Gardner の胚盤胞等級付けシステムに従って分類されました。 このシステムは、内部細胞量 (ICM) と栄養外胚葉 (TE) の品質に従って、増殖と孵化の状態のグレードを割り当てます。 良質な胚盤胞は、6、5、4、または 3AA、AB、BA の胚盤胞として分類されました。 良好な品質の胚盤胞は、BB 数が 6、5、4、または 3 の胚盤胞でした。

7-統計分析 受精、卵割、胚盤胞形成、および高品質の胚盤胞の割合を各グループのパーセンテージとして報告しました。 男性と女性の患者の特徴（年齢、精子数、精子の運動性、精子の形態、回収された卵母細胞の数、成熟卵母細胞と未成熟卵母細胞の数）は、平均±標準偏差（SD）として表されました。 Student t 検定を使用して、連続変数 (受精率、卵割、胚盤胞形成、および高品質の胚盤胞) を比較しました。 統計分析は SPSS 13.0 で実行されました。 P 値 ≤ 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。