Résultat de l'utilisation de sperme lié à la zone pellucide d'ovocytes immatures pour l'injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI)

La qualité du sperme sélectionné utilisé pour l'injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) joue un rôle préjudiciable sur la qualité et le développement embryonnaire. Dans la fécondation in vitro (FIV) et pendant le voyage du sperme à travers l'appareil reproducteur féminin in vivo, les spermatozoïdes interagissent avec la zone pellucide (ZP) de l'ovocyte, qui est la dernière étape de la sélection des spermatozoïdes avant d'entrer dans l'ovocyte. Le ZP est sélectif en ce qui concerne la liaison et peut se lier aux spermatozoïdes fonctionnant normalement, en particulier ceux ayant une région acrosomique normale. Selon Liu et al., seuls 14 % des spermatozoïdes mobiles chez les hommes fertiles peuvent se lier à la ZP. Seuls les spermatozoïdes dont la taille et la forme de la région acrosomique sont relativement normales et ceux dont la fragmentation de l'acide désoxyribonucléique (ADN) est nulle ou faible peuvent se lier à la ZP et fusionner avec la membrane plasmique de l'ovocyte (oolemme) et sont ainsi capables de féconder le ovocyte. Le sperme humain varie en taille, morphologie, intégrité de l'ADN, motilité, composition de la membrane, etc., et cela peut être observé même dans le même éjaculat. Il est un fait établi que des procédures rigoureuses de sélection des spermatozoïdes s'appliquent aux spermatozoïdes dans le tractus génital féminin pour filtrer les spermatozoïdes supérieurs et ne permettre qu'à une petite sous-population de spermatozoïdes de qualité supérieure d'atteindre le site de fécondation où une autre sélection de spermatozoïdes a lieu (c'est-à-dire interaction ZP).

Les caractéristiques du sperme qui rendent la fécondation in vitro efficace sont encore débattues. L'ICSI est désormais la pratique standard pour la plupart des centres de technologies de procréation assistée (ART) dans le monde et représente environ 70 % de toutes les fécondations in vitro. La sélection de routine des spermatozoïdes pour l'ICSI dépend de la sélection subjective par un embryologiste des spermatozoïdes en fonction de leur motilité et de leur morphologie. Elle se fait après une analyse du liquide séminal, qui est un mauvais outil prédictif de la fertilité masculine et n'exprime pas la capacité de fécondation du sperme. Il avait supposé que l'imitation de la sélection naturelle des spermatozoïdes pouvait améliorer la qualité des spermatozoïdes sélectionnés et, par conséquent, les résultats cliniques de l'ICSI. Idéalement, une méthode de sélection des spermatozoïdes qui réduit le nombre de spermatozoïdes à une sous-population potentiellement de la plus haute qualité peut améliorer la fécondation et la qualité et le développement des embryons et les résultats cliniques ultérieurs de l'ICSI.

Au fil des ans, plusieurs techniques de sélection des spermatozoïdes ont été développées pour l'ICSI. Cependant, ces techniques ont été conçues pour sélectionner les spermatozoïdes en fonction d'un seul paramètre du sperme (c'est-à-dire motilité, densité, sédimentation, intégrité nucléaire, etc.) et en ignorant les autres paramètres du sperme liés à la capacité de féconder l'ovocyte. Les techniques de sélection des spermatozoïdes telles que la natation, la microfluidique et la centrifugation en gradient de densité produisent une population de spermatozoïdes hautement mobiles, mais ne parviennent pas à imiter la sélection naturelle rigoureuse des spermatozoïdes qui prend en compte d'autres paramètres du sperme. De plus, la plupart de ces méthodes nécessitent une centrifugation qui peut affecter négativement l'ADN paternel et réduire la qualité du sperme en augmentant les espèces réactives de l'oxygène. Suite à ces techniques, un embryologiste doit sélectionner subjectivement les spermatozoïdes en fonction de leur motilité et de leur morphologie, ce qui ne garantit pas l'intégrité de l'ADN et peut prendre du temps.

L'une des méthodes de sélection de spermatozoïdes développées pour dupliquer relativement la sélection naturelle est les boîtes d'injection intracytoplasmique de spermatozoïdes physiologiques (PICSI)® basées sur la liaison de l'acide hyaluronique (HA). La couche de cumulus oophorus entourant l'ovocyte est principalement constituée de HA. Cependant, il existe des données contradictoires sur les résultats à l'aide de plats PICSI. De plus, la liaison spermatozoïde-ZP comprend des paramètres autres que HA qui ne figurent pas dans les boîtes PICSI.

L'interaction spermatozoïdes-ovocytes est un processus en plusieurs étapes impliquant des interactions physiques et moléculaires. Il s'agit d'un processus complexe et complémentaire à base de récepteurs/ligands entre les protéines de surface exprimées sur la ZP et le sperme. La recherche a dévoilé plusieurs protéines candidates ZP supposées jouer un rôle dans la liaison des spermatozoïdes. La protéine principale de ceux-ci est la glycoprotéine 3 de la zone pellucide (ZP3), dont les chaînes oligosaccharidiques liées par O se lient à un sperme intact en acrosome et induisent une réaction acrosomique.

L'étude comprenait 20 patients subissant une ICSI

Nos critères d'inclusion comprenaient :

Âge féminin ≤ 38 ans. Âge masculin ≤ 50 ans. Avoir au moins un ovocyte immature (c'est-à-dire vésicule germinale (GV) ou ovocyte en métaphase I (MI)) pour l'incubation avec le sperme afin de préserver les matures pour l'ICSI.

Au moins 10 % de motilité des spermatozoïdes et donc des échantillons de sperme testiculaire ont été exclus. Les patients ont été sélectionnés sur la base du pourcentage de fragmentation de l'ADN et seuls ceux avec ≤ 20% ont été recrutés. Les ovocytes frères et sœurs ont été divisés au hasard en un groupe témoin et un groupe d'intervention. Les ovocytes du groupe témoin ont reçu une injection de spermatozoïdes sélectionnés de manière conventionnelle en fonction de la morphologie et de la motilité des spermatozoïdes. Pour le groupe d'intervention, un ovocyte immature a été incubé avec un volume calculé de sperme traité avec une concentration de 500 000 spermatozoïdes mobiles/ovocyte dans un incubateur à dioxyde de carbone (CO2) pendant 10 à 30 minutes, puis vérifié pour le sperme lié sous un microscope inversé . Seuls les spermatozoïdes liés de morphologie normale ont été sélectionnés et transférés dans une goutte de Polyvinylpyrrolidone (PVP) pour immobilisation puis injectés dans le cytoplasme des ovocytes MII des groupes d'intervention.

Manipulations cliniques

1. Hyperstimulation ovarienne contrôlée (COH) : toutes les patientes ont reçu une injection quotidienne d'hormone folliculo-stimulante sous-cutanée (Gn, Gonal-F, Merck Serono, États-Unis d'Amérique) du 3e au 5e jour du cycle menstruel.

Les follicules ont été vérifiés pour atteindre le diamètre approprié (c'est-à-dire 18-20 mm) et pour leur nombre à l'aide d'un appareil à ultrasons. Si deux follicules ou plus atteignaient le diamètre approprié, un déclencheur (gonadotrophine chorionique humaine (hCG)) (Ovitrelle® ; Merck Serono, Suisse) était administré par voie intramusculaire pour favoriser la maturation finale et induire l'ovulation.

2-Préparation du sperme : Après avoir demandé aux couples masculins de s'abstenir d'activités sexuelles pendant 1 à 7 jours, des échantillons de sperme ont été prélevés par masturbation. Les échantillons ont été placés à température ambiante sur des plaques chaudes ou des incubateurs à 37 °C jusqu'à ce qu'ils soient liquéfiés et le temps de liquéfaction a été enregistré.

Les évaluations macroscopiques et microscopiques ont été réalisées en utilisant le manuel de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) de 2010 comme référence. Ensuite, les échantillons ont été traités par l'une des techniques suivantes en fonction du facteur masculin :

Pour les groupes de traitement, un volume spécifique de sperme préparé a été co-incubé avec un ovocyte immature dans une boîte d'injection contenant 10 µl de micro-gouttes de milieu global (LifeGlobal, Europe) avec 3 ml de superposition d'huile minérale équilibrée stérile à 37 °C avec 6 % de CO2 pendant 10 à 30 minutes. Le volume selon l'équation:

x = (volume du culot x 0,5 x 100)/(motilité x nombre (après traitement)) 3-Récupération des ovocytes : la récupération des ovocytes a été effectuée environ 36 heures après l'administration du déclencheur d'ovulation. Sous guidage échographique, une aiguille à jauge à lumière unique (Reproline, Allemagne) avait été utilisée pour aspirer les follicules pour un prélèvement rapide d'ovocytes avec une pression négative de 115-120 mm Hg. En même temps, le liquide folliculaire a été recueilli dans des tubes Falcon stériles à fond rond de 14 ml. Sous un stéréomicroscope, les complexes ovocyte-cumulus (COC) ont été identifiés, lavés et transférés dans un milieu total global fertilisant (LifeGlobal, Europe) et incubés à 6 % de CO2 à 37 °C jusqu'à la dénudation.

4- Dénudation et notation des ovocytes : Les COC ont été dénudés en les plaçant dans une goutte de 100 µl de milieu tamponné contenant l'enzyme hyaluronidase 80 UI/ml (LifeGlobal, Europe) pendant 30 à 45 secondes. Ensuite, les ovocytes ont été doucement aspirés à l'intérieur et à l'extérieur par une pipette de stripper stérile, ce qui a entraîné l'élimination des cellules coronales (25). Ensuite, un total global w/HEPES Buffer (LifeGlobal, Europe) a été utilisé pour laver les ovocytes dénudés. Un microscope inversé équipé de manipulateurs automatiques, Narishige, platine chauffante et optique Hoffman (Olympus 1x71) a été utilisé pour évaluer la maturité des ovocytes. L'évaluation de la maturation des ovocytes était la suivante : les ovocytes matures en métaphase II (MII) caractérisés par l'extrusion du globule polaire, et les ovocytes immatures étaient soit en phase de vésicule germinale (GV) caractérisée par une vésicule germinale située au centre, soit en métaphase I (MI) caractérisé par l'absence à la fois du globule polaire et de la vésicule germinale. Les ovocytes matures ont ensuite été incubés dans un milieu de culture dans un incubateur Labotect avec 6% de Co2 à 37 ºC jusqu'au moment de l'injection intracytoplasmique du sperme. En revanche, des ovocytes immatures frères et sœurs ont été incubés dans un milieu de culture (50 µ) avec une concentration de 5000 spermatozoïdes/ovocyte et placés dans l'incubateur Labotect pendant 10 à 30 minutes jusqu'au moment de la sélection des spermatozoïdes.

5- ICSI : les ovocytes matures ont été placés dans 10 µl de micro-gouttes du total global avec tampon HEPES (LifeGlobal, Europe) recouvert de 3 ml d'huile minérale pure équilibrée pour ICSI.

Dans le groupe témoin, chaque ovocyte MII a été injecté avec un sperme sélectionné de manière conventionnelle en fonction de la morphologie et de la motilité après avoir été traité par centrifugation en gradient de densité (DGC). Cependant, dans les groupes de traitement, les spermatozoïdes liés à la ZP ont été sélectionnés à partir de la surface des ovocytes immatures grâce à l'utilisation d'une micro-aiguille (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) et transférés dans une solution à 10 % de polyvinylpyrrolidone (PVP) (SAGE, USA), immobilisé, puis utilisé pour injecter des ovocytes MII frères. La procédure a été réalisée sous un microscope inversé équipé d'une pipette de maintien à légère dépression pour la manipulation de l'ovocyte et d'une aiguille d'injection pour l'injection du sperme. Les ovocytes immatures utilisés pour la sélection des spermatozoïdes ont été jetés. Dans tous les groupes, l'aiguille d'injection contenant un seul spermatozoïde était régulièrement et lentement déplacée à travers le cytoplasme de l'ovocyte MII et laissait tomber 1 à 3 µl au centre de l'ovocyte .

6- Mesures des résultats : Tous les paramètres embryologiques (c'est-à-dire fécondation, clivage, formation de blastocystes et qualité du blastocyste) ont été enregistrés et évalués. Des signes de fécondation ont été observés 16 à 18 heures après l'ICSI. De plus, 48 ​​et 72 h après l'ICSI, le taux de clivage a été évalué. Le taux de formation de blastocystes a été évalué le cinquième jour après l'ICSI. Les embryons avec formation de blastocystes de haute qualité ont été classés selon le système de classement des blastocystes de Gardner. Ce système attribue des degrés d'expansion et d'éclosion en fonction de la masse cellulaire interne (ICM) et de la qualité du trophectoderme (TE). Les blastocystes de bonne qualité ont été classés comme ceux avec 6, 5, 4 ou 3AA, AB ou BA. Les blastocystes de bonne qualité étaient ceux avec 6, 5, 4 ou 3 BB.

7-Analyse statistique Les taux de fécondation, de clivage, de formation de blastocystes et de blastocystes de haute qualité ont été rapportés en pourcentage pour chaque groupe. Les caractéristiques des patients masculins et féminins (âge, numération des spermatozoïdes, motilité des spermatozoïdes, morphologie des spermatozoïdes, nombre d'ovocytes récupérés et nombre d'ovocytes matures et immatures) ont été exprimées en moyenne ± écart type (SD). Le test t de Student a été utilisé pour comparer des variables continues (taux de fécondation, clivage, formation de blastocystes et blastocystes de haute qualité). L'analyse statistique a été réalisée avec SPSS 13.0. La valeur P ≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.