Esito dell'utilizzo di spermatozoi legati alla zona pellucida di ovociti immaturi per l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI)

La qualità dello sperma selezionato utilizzato per l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) svolge un ruolo dannoso nella qualità e nello sviluppo embrionale. Nella fecondazione in vitro (IVF) e durante il viaggio dello sperma attraverso il tratto riproduttivo femminile in vivo, lo sperma interagisce con la zona pellucida (ZP) dell'ovocita, che è l'ultima fase della selezione dello sperma prima di entrare nell'ovocita. Lo ZP è selettivo per quanto riguarda il legame e può legarsi agli spermatozoi normalmente funzionanti, in particolare quelli con una regione acrosomiale normale. Secondo Liu et al., solo il 14% degli spermatozoi mobili negli uomini fertili può legarsi alla ZP. Solo quegli spermatozoi con dimensioni e forma relativamente normali della regione acrosomiale e quelli con frammentazione dell'acido desossiribonucleico (DNA) assente o bassa possono legarsi e fondersi con la membrana plasmatica dell'ovocita (oolemma) e quindi sono in grado di fecondare il ovocita. Lo sperma umano varia in dimensioni, morfologia, integrità del DNA, motilità, composizione della membrana, ecc., e questo può essere osservato anche nello stesso eiaculato. È un dato di fatto che procedure approfondite di selezione degli spermatozoi si rivolgono agli spermatozoi nel tratto genitale femminile per filtrare lo sperma superiore e consentire solo a una piccola sottopopolazione di spermatozoi di qualità superiore di raggiungere il sito di fecondazione dove avviene un'altra selezione di spermatozoi (ad es. interazione ZP).

I tratti dello sperma che rendono efficace la fecondazione in vitro sono ancora dibattuti. L'ICSI è ora la pratica standard per la maggior parte dei centri di tecnologie di riproduzione assistita (ART) in tutto il mondo e rappresenta circa il 70% di tutta la fecondazione in vitro. La selezione di routine degli spermatozoi per l'ICSI dipende da un embriologo che seleziona soggettivamente gli spermatozoi in base alla loro motilità e morfologia. Viene effettuata dopo un'analisi del liquido seminale, che è uno scarso strumento predittivo della fertilità maschile e non esprime la capacità di fecondazione degli spermatozoi. Si presumeva che l'imitazione della selezione naturale degli spermatozoi potesse migliorare la qualità degli spermatozoi selezionati e, quindi, i risultati clinici dell'ICSI. Idealmente, un metodo di selezione dello sperma che riduca il numero di spermatozoi a una sottopopolazione con la qualità potenzialmente più elevata può migliorare la fecondazione, la qualità e lo sviluppo dell'embrione e i successivi esiti clinici dell'ICSI.

Nel corso degli anni sono state sviluppate diverse tecniche di selezione dello sperma per l'ICSI. Tuttavia, queste tecniche sono state progettate per selezionare lo sperma sulla base di un singolo parametro spermatico (ad es. motilità, densità, sedimentazione, integrità nucleare, ecc.) e ignorando altri parametri dello sperma relativi alla capacità di fecondare l'ovocita. Tecniche di selezione dello sperma come swim-up, microfluidica e centrifugazione in gradiente di densità producono una popolazione di spermatozoi altamente mobili ma non riescono a imitare la rigorosa selezione naturale dello sperma che considera altri parametri dello sperma. Inoltre, la maggior parte di questi metodi richiede la centrifugazione che può influire negativamente sul DNA paterno e riduce la qualità dello sperma aumentando le specie reattive dell'ossigeno. Seguendo queste tecniche, un embriologo deve selezionare soggettivamente gli spermatozoi in base alla loro motilità e morfologia, il che non garantisce l'integrità del DNA ed è potenzialmente dispendioso in termini di tempo.

Uno dei metodi di selezione dello sperma sviluppati per duplicare relativamente la selezione naturale è l'iniezione fisiologica intracitoplasmatica di spermatozoi (PICSI)® basata sul legame dell'acido ialuronico (HA). Lo strato di cumulo ooforo che circonda l'ovocita è costituito principalmente da HA. Tuttavia, ci sono dati contrastanti sui risultati usando le antenne PICSI. Inoltre, il legame sperma-ZP comprende parametri diversi dall'HA che non sono presenti nei piatti PICSI.

L'interazione spermatozoo-ovocita è un processo in più fasi che coinvolge interazioni fisiche e molecolari. Implica un processo complesso e complementare basato su recettore/ligando tra le proteine ​​di superficie espresse sulla ZP e lo sperma. La ricerca ha svelato diversi candidati alla proteina ZP ipotizzati per svolgere un ruolo nel legare lo sperma. La proteina principale di queste è la glicoproteina 3 della zona pellucida (ZP3), le cui catene oligosaccaridiche legate all'O si legano a uno spermatozoo acrosomiale intatto e inducono una reazione acrosomiale.

Lo studio consisteva di 20 pazienti sottoposti a ICSI

I nostri criteri di inclusione includevano:

Età femminile ≤ 38 anni. Età maschile ≤ 50 anni. Avere almeno un ovocita immaturo (es. vescicola germinale (GV) o metafase I (MI) ovocita) per l'incubazione con lo sperma per preservare quelli maturi per ICSI.

Sono stati esclusi almeno il 10% della motilità degli spermatozoi e quindi i campioni di spermatozoi testicolari. I pazienti sono stati selezionati in base alla percentuale di frammentazione del DNA e sono stati reclutati solo quelli con ≤ 20%. Gli ovociti di pari livello sono stati divisi casualmente in un gruppo di controllo e uno di intervento. Gli ovociti del gruppo di controllo sono stati iniettati con spermatozoi selezionati convenzionalmente in base alla morfologia e alla motilità degli spermatozoi. Per il gruppo di intervento, un ovocita immaturo è stato incubato con un volume calcolato di seme processato con una concentrazione di 500.000 spermatozoi/ovociti mobili in un incubatore ad anidride carbonica (CO2) per 10-30 minuti e poi controllato per lo sperma legato sotto un microscopio invertito . Solo gli spermatozoi legati con morfologia normale sono stati selezionati e trasferiti in una goccia di polivinilpirrolidone (PVP) per l'immobilizzazione e quindi iniettati nel citoplasma degli ovociti MII dei gruppi di intervento.

Manipolazioni cliniche

1. Iperstimolazione ovarica controllata (COH): a tutte le pazienti di sesso femminile è stato somministrato giornalmente un ormone follicolo-stimolante sottocutaneo (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Stati Uniti d'America) dal 3° al 5° giorno del ciclo mestruale.

I follicoli sono stati controllati per raggiungere il diametro appropriato (es. 18-20 mm) e per il loro numero utilizzando un dispositivo ad ultrasuoni. Se due o più follicoli raggiungevano il diametro appropriato, veniva somministrato per via intramuscolare un trigger (gonadotropina corionica umana (hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Svizzera) per incoraggiare la maturazione finale e indurre l'ovulazione.

2-Preparazione dello sperma: dopo che le coppie maschili erano state istruite ad astenersi da attività sessuali da 1 a 7 giorni, i campioni di sperma sono stati raccolti mediante masturbazione. I campioni sono stati posti a temperatura ambiente su piastre calde o incubatrici a 37ºC fino a quando non sono stati liquefatti ed è stato registrato il tempo di liquefazione.

Entrambe le valutazioni macroscopiche e microscopiche sono state eseguite utilizzando come riferimento il manuale dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) del 2010. Quindi, i campioni sono stati trattati con una delle seguenti tecniche a seconda del fattore maschile:

Per i gruppi di trattamento, un volume specifico del seme preparato è stato co-incubato con un ovocita immaturo in una piastra di iniezione contenente 10 µl di microgocce di terreno globale (LifeGlobal, Europa) con 3 ml di olio minerale sterile ed equilibrato a 37 °C con il 6% di CO2 per 10-30 minuti. Il volume secondo l'equazione:

x=(volume pellet x 0,5 x 100)/(motilità x conteggio (dopo l'elaborazione)) 3-Recupero degli ovociti: il recupero degli ovociti è stato eseguito circa 36 ore dopo la somministrazione del trigger di ovulazione. Sotto guida ecografica, è stato utilizzato un ago a singolo lume (Reproline, Germania) per aspirare i follicoli per il prelievo rapido degli ovociti con una pressione negativa di 115-120 mm Hg. Allo stesso tempo, il fluido follicolare era stato raccolto in provette Falcon sterili a fondo tondo da 14 ml. Sotto un microscopio stereo, i complessi ovocita-cumulo (COC) sono stati identificati, lavati e trasferiti in terreni totali fertilizzanti globali (LifeGlobal, Europa) e incubati al 6% di CO2 a 37°C fino alla denudazione.

4- Denudazione e punteggio degli ovociti: i COC sono stati denudati ponendoli in una goccia da 100 µ1 di terreno tamponato contenente enzima ialuronidasi 80 UI/ml (LifeGlobal, Europa) per 30-45 secondi. Quindi gli ovociti sono stati delicatamente aspirati dentro e fuori da una pipetta stripper sterile con conseguente rimozione delle cellule coronali (25). Successivamente, è stato utilizzato un tampone w/HEPES totale globale (LifeGlobal, Europa) per lavare gli ovociti denudati. Per valutare la maturità degli ovociti è stato utilizzato un microscopio invertito dotato di manipolatori automatici, Narishige, hot stage e ottica Hoffman (Olympus 1x71). La valutazione della maturazione degli ovociti era la seguente: gli ovociti maturi nella metafase II (MII) caratterizzati dall'estrusione del corpo polare, e gli ovociti immaturi erano nella fase della vescicola germinale (GV) caratterizzata da una vescicola germinale in posizione centrale o nella metafase I (MI) caratterizzato dall'assenza sia del corpo polare che della vescicola germinale. Gli ovociti maturi sono stati quindi incubati in un terreno di coltura in un incubatore Labotect con il 6% di Co2 a 37 ºC fino al momento dell'iniezione intracitoplasmatica dello sperma. Al contrario, gli ovociti immaturi fratelli sono stati incubati in un terreno di coltura (50 µ) con una concentrazione di 5000 di spermatozoi/ovocita e posti nell'incubatore Labotect per 10-30 minuti fino al momento della selezione dello sperma.

5- ICSI: gli ovociti maturi sono stati collocati in 10 µl di microgocce del tampone w/HEPES totale globale (LifeGlobal, Europa) ricoperti con 3 ml di olio minerale puro equilibrato per ICSI.

Nel gruppo di controllo, a ciascun ovocita MII è stato iniettato uno spermatozoo selezionato convenzionalmente in base alla morfologia e alla motilità dopo essere stato processato mediante centrifugazione in gradiente di densità (DGC). Tuttavia, nei gruppi di trattamento, gli spermatozoi legati alla ZP sono stati selezionati dalla superficie degli ovociti immaturi attraverso l'uso di un microago (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) e trasferiti in una soluzione al 10% di polivinilpirrolidone (PVP) (SAGE, USA), immobilizzato e quindi utilizzato per iniettare ovociti MII di pari livello. La procedura è stata eseguita sotto un microscopio invertito dotato di una pipetta di tenuta con una leggera pressione negativa per la manipolazione dell'ovocita e di un ago per iniezione per l'iniezione dello sperma. Gli ovociti immaturi utilizzati per la selezione degli spermatozoi sono stati scartati. In tutti i gruppi, l'ago per l'iniezione contenente un singolo spermatozoo è stato spostato costantemente e lentamente attraverso il citoplasma dell'ovocita MII e ha fatto cadere da 1 a 3 µl al centro dell'ovocita.

6- Misure di risultato: tutti i parametri embriologici (es. fecondazione, scissione, formazione di blastocisti e qualità della blastocisti) sono stati registrati e valutati. Segni di fecondazione sono stati osservati 16-18 ore dopo l'ICSI. Inoltre, 48 e 72 ore dopo l'ICSI, è stato valutato il tasso di scissione. Il tasso di formazione di blastocisti è stato valutato il quinto giorno post-ICSI. Gli embrioni con formazione di blastocisti di alta qualità sono stati classificati secondo il sistema di classificazione dei blastocisti di Gardner. Questo sistema assegna i gradi dello stato di espansione e schiusa in base alla massa cellulare interna (ICM) e alla qualità del trofectoderma (TE). Le blastocisti di buona qualità sono state classificate come quelle con 6, 5, 4 o 3AA, AB o BA. Le blastocisti di buona qualità erano quelle con 6, 5, 4 o 3 BB.

7-Analisi statistica I tassi di fecondazione, scissione, formazione di blastocisti e blastocisti di alta qualità sono stati riportati come percentuali per ciascun gruppo. Le caratteristiche dei pazienti maschi e femmine (età, numero di spermatozoi, motilità degli spermatozoi, morfologia degli spermatozoi, numero di ovociti recuperati e numero di ovociti maturi e immaturi) sono state espresse come media ± deviazione standard (SD). Il test t di Student è stato impiegato per confrontare variabili continue (tassi di fecondazione, scissione, formazione di blastocisti e blastocisti di alta qualità). L'analisi statistica è stata eseguita con SPSS 13.0. Il valore P ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.