Výsledek použití spermií vázaných na zona Pellucida nezralých oocytů pro intracytoplazmatickou injekci spermií (ICSI)

Kvalita vybraných spermií použitých pro intracytoplazmatickou injekci spermie (ICSI) hraje nepříznivou roli v kvalitě a vývoji embrya. Při in vitro fertilizaci (IVF) a během cesty spermií ženským reprodukčním traktem in vivo spermie interagují se zona pellucida (ZP) oocytu, což je poslední fáze výběru spermií před vstupem do oocytu. ZP je selektivní s ohledem na vazbu a může se vázat na normálně fungující spermie, zejména ty s normální akrozomální oblastí. Podle Liu et al. se pouze 14 % pohyblivých spermií u fertilních mužů může vázat na ZP. Pouze spermie s relativně normální velikostí a tvarem akrozomální oblasti a spermie s žádnou nebo nízkou fragmentací deoxyribonukleové kyseliny (DNA) se mohou vázat na ZP a fúzovat s plazmatickou membránou oocytu (oolemma), a tak jsou schopny oplodnit oocyt. oocyt. Lidské spermie se liší velikostí, morfologií, integritou DNA, pohyblivostí, složením membrán atd., a to lze pozorovat i ve stejném ejakulátu. Je samozřejmé, že důkladné postupy selekce spermií postihují spermie v ženském genitálním traktu, aby filtrovaly nadřazené spermie a umožnily pouze malé subpopulaci spermií s vynikající kvalitou dosáhnout místa oplodnění, kde dochází k dalšímu výběru spermií (tj. interakce ZP).

O vlastnostech spermií, které činí in vitro fertilizaci účinnou, se stále diskutuje. ICSI je nyní standardní praxí pro většinu center asistované reprodukce (ART) po celém světě a představuje přibližně 70 % veškerého oplodnění in vitro. Rutinní výběr spermií pro ICSI závisí na tom, zda embryolog subjektivně vybírá spermie na základě jejich motility a morfologie. Provádí se po analýze semenné tekutiny, která je špatným prediktivním nástrojem mužské plodnosti a nevyjadřuje fertilizační kapacitu spermií. Předpokládalo se, že napodobování přirozeného výběru spermií může zlepšit kvalitu vybraných spermií a tím i klinické výsledky ICSI. V ideálním případě může metoda výběru spermií, která redukuje počet spermií na subpopulaci s potenciálně nejvyšší kvalitou, zlepšit oplodnění a kvalitu a vývoj embryí a následné klinické výsledky ICSI.

V průběhu let bylo pro ICSI vyvinuto několik technik výběru spermií. Tyto techniky však byly navrženy pro výběr spermií na základě jediného parametru spermatu (tj. motilita, hustota, sedimentace, jaderná integrita atd.) a ignorování dalších parametrů spermií souvisejících se schopností oplodnit oocyt. Techniky selekce spermií, jako je plavání nahoru, mikrofluidika a centrifugace s hustotním gradientem, poskytují populaci vysoce pohyblivých spermií, ale nenapodobují přísný přirozený výběr spermií, který bere v úvahu jiné parametry spermií. Navíc většina těchto metod vyžaduje centrifugaci, která může negativně ovlivnit otcovskou DNA a snížit kvalitu spermií zvýšením reaktivních forem kyslíku. Podle těchto technik musí embryolog subjektivně vybrat spermie na základě jejich motility a morfologie, což nezaručuje integritu DNA a je potenciálně časově náročné.

Jednou z vyvinutých metod selekce spermií, která relativně duplikuje přirozený výběr, jsou misky s fyziologickou intracytoplazmatickou injekcí spermií (PICSI)® založené na vazbě kyseliny hyaluronové (HA). Vrstva cumulus oophorus obklopující oocyt sestává převážně z HA. Existují však rozporuplné údaje o výsledcích s použitím misek PICSI. Navíc vazba spermie-ZP zahrnuje parametry jiné než HA, které nejsou uvedeny v miskách PICSI.

Interakce spermie a oocytu je vícestupňový proces zahrnující fyzikální a molekulární interakce. Zahrnuje komplexní a komplementární proces založený na receptoru/ligandu mezi povrchovými proteiny exprimovanými na ZP a spermií. Výzkum odhalil několik kandidátů na protein ZP, o kterých se předpokládá, že hrají roli ve vazbě spermií. Hlavním z nich je glykoprotein 3 zona pellucida (ZP3), jehož O-vázané oligosacharidové řetězce se vážou na akrozom intaktní spermie a indukují akrozomální reakci.

Studie se skládala z 20 pacientů podstupujících ICSI

Naše kritéria zařazení zahrnovala:

Věk ženy ≤ 38 let. Věk muže ≤ 50 let. Mít alespoň jeden nezralý oocyt (tj. germinální váček (GV) nebo oocyt metafáze I (MI) pro inkubaci se spermiemi, aby se zachovaly zralé pro ICSI.

Nejméně 10% pohyblivost spermií a tedy vzorky spermií varlat byly vyloučeny. Pacienti byli vybráni na základě procenta fragmentace DNA a byli vybráni pouze pacienti s ≤ 20 %. Sourozenecké oocyty byly náhodně rozděleny do kontrolní a intervenční skupiny. Oocyty kontrolní skupiny byly injikovány konvenčně vybranými spermiemi na základě morfologie a motility spermií. Pro intervenční skupinu byl jeden nezralý oocyt inkubován s vypočítaným objemem zpracovaného spermatu o koncentraci 500 000 pohyblivých spermií/oocyt v inkubátoru s oxidem uhličitým (CO2) po dobu 10 až 30 minut a poté byl kontrolován na navázané spermie pod inverzním mikroskopem . Pouze navázané spermie s normální morfologií byly vybrány a přeneseny do kapky polyvinylpyrrolidonu (PVP) pro imobilizaci a poté injikovány do cytoplazmy MII oocytů intervenčních skupin.

Klinické manipulace

1. Kontrolovaná ovariální hyperstimulace (COH): Všem pacientkám byl denně injikován subkutánní folikuly stimulující hormon (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Spojené státy americké) od 3. do 5. dne menstruačního cyklu.

Folikuly byly zkontrolovány na dosažení vhodného průměru (tj. 18-20 mm) a pro jejich počet pomocí ultrazvukového přístroje. Pokud dva nebo více folikulů dosáhlo vhodného průměru, byl intramuskulárně podán spouštěč (lidský choriový gonadotropin (hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Švýcarsko), aby se podpořilo konečné zrání a indukce ovulace.

Příprava 2 spermií: Poté, co byly mužské páry instruovány, aby se zdržely sexuálních aktivit po dobu 1 až 7 dnů, byly vzorky spermatu odebrány masturbací. Vzorky byly umístěny při pokojové teplotě na teplé plotny nebo inkubátory při 37 °C, dokud nebyly zkapalněny a byla zaznamenána doba zkapalnění.

Jak makroskopická, tak mikroskopická hodnocení byla provedena s použitím manuálu Světové zdravotnické organizace (WHO) z roku 2010 jako reference. Poté byly vzorky ošetřeny jednou z následujících technik v závislosti na mužském faktoru:

U léčených skupin byl specifický objem připraveného spermatu společně inkubován s nezralým oocytem v injekční misce obsahující 10 µl mikrokapek globálního média (LifeGlobal, Evropa) s 3 ml sterilního ekvilibrovaného minerálního oleje překrytím při 37 °C s 6 % CO2 po dobu 10-30 minut. Objem podle rovnice:

x=(objem pelety x 0,5 x 100)/(motilita x počet (po zpracování)) 3-Odběr oocytů: Odběr oocytů byl proveden přibližně 36 hodin po podání spouštěče ovulace. Pod ultrazvukovou kontrolou byla k odsátí folikulů použita jedna jehla s průměrem lumen (Reproline, Německo) pro rychlý odběr oocytů s podtlakem 115-120 mm Hg. Ve stejnou dobu byla folikulární tekutina shromážděna do sterilních 14ml zkumavek Falcon s kulatým dnem. Pod stereomikroskopem byly identifikovány komplexy oocyt-cumulus (COC), promyty a přeneseny do fertilizačního globálního celkového média (LifeGlobal, Evropa) a inkubovány při 6% CO2 při 37 °C až do denudace.

4- Denudace oocytů a hodnocení: COC byly denudovány jejich umístěním do 100 ul kapky pufrovaného média obsahujícího hyaluronidázový enzym 80 IU/ml (LifeGlobal, Evropa) na 30 až 45 sekund. Poté byly oocyty jemně nasávány dovnitř a ven pomocí sterilní stripovací pipety, což vedlo k odstranění koronálních buněk (25). Poté byl k promytí denudovaných oocytů použit globální celkový pufr W/HEPES (LifeGlobal, Evropa). Pro hodnocení zralosti oocytů byl použit inverzní mikroskop vybavený automatickými manipulátory, Narishige, horkým stolkem a Hoffmanovou optikou (Olympus 1x71). Hodnocení zrání oocytů bylo následující: zralé oocyty v metafázi II (MII) charakterizované extruzí polárního tělíska a nezralé oocyty byly buď ve fázi germinálních váčků (GV) charakterizované centrálně umístěným zárodečným váčkem nebo v metafázi I (MI) charakterizovaný absencí jak polárního tělíska, tak zárodečného váčku. Zralé oocyty byly poté inkubovány v kultivačním médiu v inkubátoru Labotect s 6% Co2 při 37 °C až do doby intracytoplazmatické injekce spermatu. Naproti tomu nezralé oocyty sourozenců byly inkubovány v kultivačním médiu (50 u) s koncentrací 5000 spermií/oocyt a umístěny do inkubátoru Labotect na 10-30 minut do doby selekce spermií.

5- ICSI: Zralé oocyty byly umístěny do 10 ul mikrokapek celkového celkového pufru W/HEPES (LifeGlobal, Evropa) pokrytých 3 ml čistého vyváženého minerálního oleje pro ICSI.

V kontrolní skupině byla každému MII oocytu injikována konvenčně vybraná spermie na základě morfologie a motility po zpracování centrifugací v hustotním gradientu (DGC). V léčebných skupinách však byly spermie navázané na ZP vybrány z povrchu nezralých oocytů pomocí mikrojehly (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) a přeneseny v 10% roztoku polyvinylpyrrolidonu (PVP) (SAGE, USA), imobilizován a poté použit k injekci sourozeneckých MII oocytů. Postup byl proveden pod inverzním mikroskopem vybaveným přídržnou pipetou s mírným podtlakem pro manipulaci s oocytem a injekční jehlou pro injekci spermatu. Nezralé oocyty použité pro selekci spermií byly vyřazeny. Ve všech skupinách se injekční jehla obsahující jednu spermii plynule a pomalu pohybovala cytoplazmou oocytu MII a kapala 1 až 3 ul do středu oocytu.

6- Měření výsledku: Všechny embryologické parametry (tj. fertilizace, štěpení, tvorba blastocyst a kvalita blastocyst) byly zaznamenány a hodnoceny. Známky oplodnění byly pozorovány 16-18 hodin po ICSI. Dále, 48 a 72 hodin po ICSI byla hodnocena rychlost štěpení. Rychlost tvorby blastocyst byla hodnocena pátý den po ICSI. Embrya s vysoce kvalitní tvorbou blastocyst byla klasifikována podle Gardnerova systému klasifikace blastocyst. Tento systém přiděluje stupně expanze a stavu líhnutí podle vnitřní buněčné hmoty (ICM) a kvality trofektodermu (TE). Kvalitní blastocysty byly klasifikovány jako blastocysty s 6, 5, 4 nebo 3 AA, AB nebo BA. Blastocysty dobré kvality byly ty s 6, 5, 4 nebo 3 BB.

7-Statistická analýza Rychlosti oplodnění, štěpení, tvorby blastocyst a vysoce kvalitních blastocyst byly uvedeny v procentech pro každou skupinu. Charakteristiky mužských a ženských pacientů (věk, počet spermií, pohyblivost spermií, morfologie spermií, počet získaných oocytů a počet zralých a nezralých oocytů) byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (SD). Studentův t-test byl použit k porovnání spojitých proměnných (rychlost oplodnění, štěpení, tvorba blastocyst a vysoce kvalitní blastocysty). Statistická analýza byla provedena pomocí SPSS 13.0. P-hodnota ≤ 0,05 byla považována za statisticky významnou.