Resultat av användning av spermier bundna till Zona Pellucida av omogna oocyter för intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI)

Kvaliteten på den utvalda sperma som används för intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) spelar en skadlig roll för embryonal kvalitet och utveckling. Vid provrörsbefruktning (IVF) och under spermieresan genom det kvinnliga fortplantningsorganet in vivo interagerar spermier med zona pellucida (ZP) i oocyten, vilket är det sista steget av spermieurvalet innan de går in i oocyten. ZP är selektiv med avseende på bindning och kan binda till normalt fungerande spermier, särskilt de med en normal akrosomal region. Enligt Liu et al. kan endast 14 % av de rörliga spermatozoerna hos fertila män binda till ZP. Endast de spermier med relativt normal storlek och form av den akrosomala regionen och de med ingen eller låg fragmentering av deoxiribonukleinsyra (DNA) kan binda till och ZP och smälta samman med oocytens plasmamembran (oolemma) och kan således befrukta oocyt. Mänskliga spermier varierar i storlek, morfologi, DNA-integritet, motilitet, membransammansättning, etc., och detta kan observeras även i samma ejakulat. Det är ett givet faktum att noggranna spermierurvalsprocedurer drabbar spermier i det kvinnliga könsorganet för att filtrera överlägsna spermier och tillåta endast en liten subpopulation av spermier med överlägsen kvalitet att nå platsen för befruktning där en annan spermieselektion sker (dvs. ZP-interaktion).

De spermieegenskaper som gör provrörsbefruktning effektiv är fortfarande omdiskuterade. ICSI är nu standardpraxis för de flesta ART-center (Assisted Reproduction Technologies) över hela världen och står för cirka 70 % av all provrörsbefruktning. Rutinvalet av spermier för ICSI beror på att en embryolog subjektivt väljer spermier baserat på deras motilitet och morfologi. Det görs efter en analys av sädesvätskan, som är ett dåligt prediktivt verktyg för manlig fertilitet och inte uttrycker spermiernas befruktningskapacitet. Den hade antagit att efterlikning av det naturliga spermievalet kan förbättra kvaliteten på utvalda spermier och därmed de kliniska resultaten av ICSI. Helst kan en spermieselektionsmetod som reducerar antalet spermier till en subpopulation med potentiellt högsta kvalitet förbättra befruktning och embryonkvalitet och utveckling och efterföljande kliniska resultat av ICSI.

Under åren har flera spermieselektionstekniker utvecklats för ICSI. Dessa tekniker utformades dock för att välja spermier baserat på en enda spermieparameter (dvs. motilitet, densitet, sedimentation, nukleär integritet, etc.) och ignorerar andra spermieparametrar relaterade till förmågan att befrukta oocyten. Spermieselektionstekniker såsom swim-up, mikrofluidik och densitetsgradientcentrifugering ger en population av mycket rörliga spermier men misslyckas med att efterlikna det rigorösa naturliga spermievalet som tar hänsyn till andra spermieparametrar. Dessutom kräver de flesta av dessa metoder centrifugering vilket kan negativt påverka faderns DNA och minskar kvaliteten på spermier genom att öka reaktiva syrearter. Efter dessa tekniker måste en embryolog subjektivt välja spermier baserat på deras motilitet och morfologi, vilket inte garanterar DNA-integritet och är potentiellt tidskrävande.

En av de utvecklade spermieselektionsmetoderna för att relativt duplicera det naturliga urvalet är hyaluronsyra (HA)-bindningsbaserade Physiological intracytoplasmic sperm injection (PICSI)®-skålar. Cumulus oophorus-skiktet som omger oocyten består huvudsakligen av HA. Det finns dock motstridiga uppgifter om resultaten med PICSI-rätter. Dessutom innefattar sperma-ZP-bindning andra parametrar än HA som inte finns med i PICSI-rätter.

Sperma-oocytinteraktion är en process i flera steg som involverar fysiska och molekylära interaktioner. Det involverar en komplex och komplementär receptor/ligand-baserad process mellan ytproteinerna som uttrycks på ZP och spermierna. Forskning har avslöjat flera ZP-proteinkandidater som antas spela en roll för att binda spermier. Huvudproteinet av dessa är zona pellucida glykoprotein 3 (ZP3), vars O-kopplade oligosackaridkedjor binder till en akrosom-intakt sperma och inducerar en akrosomal reaktion.

Studien bestod av 20 patienter som genomgick ICSI

Våra inklusionskriterier inkluderade:

Kvinnlig ålder ≤ 38 år. Manlig ålder ≤ 50 år. Att ha minst en omogen oocyt (dvs. germinal vesikel (GV) eller Metafas I (MI) oocyt) för inkubation med spermier för att bevara mogna för ICSI.

Minst 10 % spermiemotilitet och därmed testikelspermaprover exkluderades. Patienterna valdes ut baserat på procentandelen av DNA-fragmentering och endast de med ≤ 20 % rekryterades. Syskonoocyter delades slumpmässigt in i en kontroll- och en interventionsgrupp. Oocyter från kontrollgruppen injicerades med konventionellt utvalda spermier baserat på spermiemorfologi och motilitet. För interventionsgruppen inkuberades en omogen oocyt med en beräknad volym av den bearbetade sperman med en koncentration av 500 000 rörliga spermier/oocyter i en koldioxid (CO2) inkubator under 10 till 30 minuter och kontrollerades sedan för bundna spermier under ett inverterat mikroskop . Endast bundna spermier med normal morfologi selekterades och överfördes till en droppe av polyvinylpyrrolidon (PVP) för immobilisering och injicerades sedan i cytoplasman hos MII-oocyterna i interventionsgrupperna.

Kliniska manipulationer

1. Kontrollerad ovariell hyperstimulering (COH): Alla kvinnliga patienter injicerades dagligen med ett subkutant follikelstimulerande hormon (Gn, Gonal-F, Merck Serono, USA) från den 3:e till den 5:e dagen av menstruationscykeln.

Folliklarna kontrollerades för att nå lämplig diameter (dvs. 18-20 mm) och för deras antal med hjälp av en ultraljudsapparat. Om två eller flera folliklar nådde lämplig diameter, administrerades en trigger (humant koriongonadotropin (hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Schweiz) intramuskulärt för att uppmuntra slutlig mognad och inducera ägglossning.

Beredning av 2-spermier: Efter att manliga par hade instruerats att avstå från sexuella aktiviteter i 1 till 7 dagar, togs spermaprover genom onani. Prover placerades vid rumstemperatur på varma plattor eller inkubatorer vid 37°C tills de hade flytande och tiden för flytande registrerades.

Både makroskopiska och mikroskopiska bedömningar utfördes med 2010 års manual från Världshälsoorganisationen (WHO) som referens. Sedan behandlades prover med en av följande tekniker beroende på den manliga faktorn:

För behandlingsgrupperna saminkuberades en specifik volym av den beredda sperman med en omogen oocyt i en injektionsskål innehållande 10 µl mikrodroppar globalt medium (LifeGlobal, Europa) med 3 ml sterilt ekvilibrerad mineralolja överlag vid 37 °C med 6 % CO2 i 10-30 minuter. Volymen enligt ekvationen:

x=(pelletvolym x 0,5 x 100)/(motilitet x antal (efter bearbetning)) 3-Oocytåterhämtning: Oocytåtervinning utfördes ungefär 36 timmar efter administreringen av ägglossningsutlösaren. Under ultraljudsledning hade en nål med enkel lumen (Reproline, Tyskland) använts för att aspirera folliklarna för snabb oocytupptagning med ett undertryck på 115-120 mm Hg. Samtidigt hade follikelvätskan samlats upp i rundbottnade sterila 14 ml falkrör. Under ett stereomikroskop identifierades oocyt-cumulus-komplexen (COCs), tvättades och överfördes till befruktande globala totalmedier (LifeGlobal, Europa) och inkuberades vid 6% CO2 vid 37 °C tills denudering.

4- Oocytavsöndring och poängsättning: COC:erna denuderades genom att placera dem i en 100 µ1 droppe buffrat medium innehållande hyaluronidasenzym 80 IE/ml (LifeGlobal, Europa) under 30 till 45 sekunder. Sedan aspirerades oocyterna försiktigt in och ut med en steril stripperpipett vilket resulterade i avlägsnande av koronala celler (25). Därefter användes en global total w/HEPES-buffert (LifeGlobal, Europa) för att tvätta de denuderade oocyterna. Ett inverterat mikroskop utrustat med automatiska manipulatorer, Narishige, hot stage och Hoffman-optik (Olympus 1x71) användes för att bedöma oocyternas mognad. Bedömningen av oocytmognad var följande: mogna oocyter i metafas II (MII) kännetecknade av extrudering av den polära kroppen, och omogna oocyter var antingen i germinal vesikelfas (GV) kännetecknad av en centralt belägen germinal vesikel eller i metafasen I (MI) kännetecknas av frånvaron av både polarkroppen och groddblåsan. Mogna oocyter inkuberades sedan i ett odlingsmedium i en Labotect-inkubator med 6% Co2 vid 37 ºC fram till tidpunkten för den intracytoplasmatiska spermieinjektionen. Däremot inkuberades omogna oocyter av syskon i ett odlingsmedium (50 µ) med en koncentration av 5000 spermier/oocyter och placerades i Labotect-inkubatorn under 10-30 minuter till tidpunkten för spermieval.

5- ICSI: Mogna oocyter placerades i 10 µl mikrodroppar av den globala totalen w/HEPES-buffert (LifeGlobal, Europa) täckt med 3 ml ren ekvilibrerad mineralolja för ICSI.

I kontrollgruppen injicerades varje MII-oocyt med en konventionellt utvald sperma baserad på morfologi och motilitet efter att ha bearbetats genom densitetsgradientcentrifugering (DGC). I behandlingsgrupperna valdes emellertid ZP-bundna spermier från ytan av de omogna oocyterna genom användning av en mikronål (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) och överfördes i en 10 % polyvinylpyrrolidon (PVP) lösning (SAGE, USA), immobiliserades och användes sedan för att injicera syskon MII oocyter. Proceduren utfördes under ett inverterat mikroskop utrustat med en hållpipett med lätt undertryck för hantering av oocyten och en injektionsnål för att injicera spermierna. De omogna oocyterna som användes för spermieselektion kasserades. I alla grupper fördes injektionsnålen innehållande en enda spermie stadigt och långsamt genom cytoplasman av MII-oocyten och föll 1 till 3 µl till mitten av oocyten.

6- Resultatmått: Alla embryologiska parametrar (dvs. fertilisering, klyvning, blastocystbildning och blastocystkvalitet) registrerades och bedömdes. Tecken på befruktning observerades 16-18 timmar efter ICSI. Vidare, 48 och 72 timmar efter ICSI, utvärderades klyvningshastigheten. Blastocystbildningshastigheten bedömdes på dag fem efter ICSI. Embryon med högkvalitativ blastocystbildning klassificerades enligt Gardners blastocystgraderingssystem. Detta system tilldelar grader av expansions- och kläckningsstatus enligt inre cellmassa (ICM) och trophectoderm (TE) kvalitet. Blastocyster av god kvalitet klassificerades som de med 6, 5, 4 eller 3AA, AB eller BA. Blastocyster av rättvis kvalitet var de med 6, 5, 4 eller 3 BB.

7-Statistisk analys Hastigheterna för befruktning, klyvning, blastocystbildning och högkvalitativa blastocyster rapporterades i procent för varje grupp. Egenskaper hos manliga och kvinnliga patienter (ålder, spermieantal, spermiemotilitet, spermiemorfologi, antal hämtade oocyter och antal mogna och omogna oocyter) uttrycktes som medel ± standardavvikelse (SD). Student t-testet användes för att jämföra kontinuerliga variabler (befruktningshastigheter, klyvning, blastocystbildning och högkvalitativa blastocyster). Statistisk analys utfördes med SPSS 13.0. P-värde ≤ 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.