Resultatet av bruk av sperm bundet til Zona Pellucida av umodne oocytter for intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI)

Kvaliteten på den utvalgte spermien som brukes til intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI) spiller en skadelig rolle i embryonal kvalitet og utvikling. Ved in vitro fertilisering (IVF) og under sædreisen gjennom den kvinnelige reproduksjonskanalen in vivo, samhandler sædcellene med zona pellucida (ZP) av oocytten, som er den siste fasen av sædseleksjon før den går inn i oocytten. ZP er selektiv med hensyn til binding og kan binde seg til normalt fungerende sædceller, spesielt de med en normal akrosomal region. I følge Liu et al. kan bare 14 % av de bevegelige sædceller hos fertile menn binde seg til ZP. Bare spermatozoer med relativt normal størrelse og form av den akrosomale regionen og de med ingen eller lav deoksyribonukleinsyre (DNA) fragmentering kan binde seg til og ZP og smelte sammen med plasmamembranen til oocytten (oolemma) og er dermed i stand til å befrukte oocytt. Menneskelige sædceller varierer i størrelse, morfologi, DNA-integritet, motilitet, membransammensetning, etc., og dette kan observeres selv i samme ejakulat. Det er et gitt faktum at grundige sædseleksjonsprosedyrer utføres på sædceller i den kvinnelige kjønnskanalen for å filtrere overlegne sædceller og tillate bare en liten underpopulasjon av sædceller med overlegen kvalitet å nå stedet for befruktning der en annen sædseleksjon finner sted (dvs. ZP-interaksjon).

Spermegenskapene som gjør prøverørsbefruktning effektiv er fortsatt omdiskutert. ICSI er nå standardpraksis for de fleste Assisted Reproduction-teknologisentre (ART) over hele verden og står for omtrent 70 % av all in vitro-fertilisering. Det rutinemessige utvalget av sædceller for ICSI avhenger av at en embryolog subjektivt velger sæd basert på deres motilitet og morfologi. Det gjøres etter en analyse av sædvæsken, som er et dårlig prediktivt verktøy for mannlig fertilitet og ikke uttrykker befruktningskapasiteten til sædcellene. Den hadde antatt at etterligning av det naturlige sædutvalget kan forbedre kvaliteten på utvalgte sædceller og dermed de kliniske resultatene av ICSI. Ideelt sett kan en sædseleksjonsmetode som reduserer antallet sædceller til en underpopulasjon med potensielt høyeste kvalitet forbedre befruktning og embryokvalitet og utvikling og påfølgende kliniske resultater av ICSI.

Gjennom årene har flere sædseleksjonsteknikker blitt utviklet for ICSI. Imidlertid ble disse teknikkene designet for å velge sperm basert på en enkelt spermparameter (dvs. motilitet, tetthet, sedimentasjon, kjernefysisk integritet, etc.) og ignorerer andre spermparametere relatert til evnen til å befrukte oocytten. Spermseleksjonsteknikker som swim-up, mikrofluidikk og tetthetsgradientsentrifugering gir en populasjon av svært bevegelige sædceller, men klarer ikke å etterligne det strenge naturlige spermutvalget som tar hensyn til andre spermparametere. Dessuten krever de fleste av disse metodene sentrifugering som kan påvirke faderens DNA negativt og reduserer kvaliteten på sædcellene ved å øke reaktive oksygenarter. Etter disse teknikkene må en embryolog subjektivt velge sædceller basert på deres motilitet og morfologi, noe som ikke garanterer DNA-integritet og er potensielt tidkrevende.

En av de utviklede spermseleksjonsmetodene for å relativt duplisere den naturlige seleksjonen er hyaluronsyre (HA) bindingsbaserte Physiological intracytoplasmic sperm injection (PICSI)® skåler. Cumulus oophorus-laget som omgir oocytten består hovedsakelig av HA. Imidlertid er det motstridende data om resultatene ved bruk av PICSI-retter. Dessuten omfatter sperm-ZP-binding andre parametere enn HA som ikke er omtalt i PICSI-retter.

Sperm-oocytt-interaksjon er en flertrinnsprosess som involverer fysiske og molekylære interaksjoner. Det involverer en kompleks og komplementær reseptor/ligand-basert prosess mellom overflateproteinene uttrykt på ZP og sædcellene. Forskning har avslørt flere ZP-proteinkandidater som postuleres å spille en rolle i binding av sædceller. Hovedproteinet av disse er zona pellucida glykoprotein 3 (ZP3), hvis O-koblede oligosakkaridkjeder binder seg til en akrosom-intakt sædcelle og induserer en akrosomal reaksjon.

Studien besto av 20 pasienter som gjennomgikk ICSI

Våre inkluderingskriterier inkluderte:

Kvinne alder ≤ 38 år gammel. Mann alder ≤ 50 år gammel. Å ha minst én umoden oocytt (dvs. germinal vesikkel (GV) eller Metafase I (MI) oocytt) for inkubasjon med sædceller for å bevare modne for ICSI.

Minst 10 % spermmotilitet og dermed testikkelspermprøver ble ekskludert. Pasientene ble valgt basert på prosentandelen av DNA-fragmentering og bare de med ≤ 20 % ble rekruttert. Søskenoocytter ble tilfeldig delt inn i en kontroll- og en intervensjonsgruppe. Oocytter fra kontrollgruppen ble injisert med konvensjonelt utvalgte spermatozoer basert på spermmorfologi og motilitet. For intervensjonsgruppen ble en umoden oocytt inkubert med et beregnet volum av den behandlede sæden med en konsentrasjon på 500 000 bevegelige sædceller/oocytter i en karbondioksid (CO2) inkubator i 10 til 30 minutter og deretter sjekket for bundet sæd under et invertert mikroskop . Bare bundet sperm med normal morfologi ble valgt og overført til en dråpe av polyvinylpyrrolidon (PVP) for immobilisering og deretter injisert i cytoplasmaet til MII-oocyttene til intervensjonsgruppene.

Kliniske manipulasjoner

1. Kontrollert ovariehyperstimulering (COH): Alle kvinnelige pasienter ble injisert daglig med et subkutant follikkelstimulerende hormon (Gn, Gonal-F, Merck Serono, USA) fra 3. til 5. dag av menstruasjonssyklusen.

Folliklene ble sjekket for å nå passende diameter (dvs. 18-20 mm) og for deres antall ved hjelp av en ultralydenhet. Hvis to eller flere follikler nådde passende diameter, ble en trigger (humant koriongonadotropin (hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Sveits) administrert intramuskulært for å oppmuntre til endelig modning og indusere eggløsning.

2-sperm forberedelse: Etter at mannlige par hadde blitt instruert om å avstå fra seksuelle aktiviteter i 1 til 7 dager, ble sædprøver tatt ved onani. Prøver ble plassert ved romtemperatur på varme plater eller inkubatorer ved 37ºC til de var flytende og tidspunktet for flytendegjøring ble registrert.

Både makroskopiske og mikroskopiske vurderinger ble utført ved å bruke 2010-håndboken fra Verdens helseorganisasjon (WHO) som referanse. Deretter ble prøver behandlet med en av følgende teknikker avhengig av den mannlige faktoren:

For behandlingsgruppene ble et spesifikt volum av den tilberedte sæden co-inkubert med en umoden oocytt i en injeksjonsskål som inneholdt 10 µl mikrodråper globalt medium (LifeGlobal, Europa) med 3 ml sterilt ekvilibrert mineraloljeoverlegg ved 37 °C med 6 % CO2 i 10-30 minutter. Volumet i henhold til ligningen:

x=(pelletvolum x 0,5 x 100)/(motilitet x telling (etter prosessering)) 3-Oocytt-uthenting: Oocytt-uthenting ble utført ca. 36 timer etter administrering av eggløsningstriggeren. Under ultralydveiledning hadde en nål med enkelt lumen (Reproline, Tyskland) blitt brukt til å aspirere folliklene for rask oppsamling av oocytter med et undertrykk på 115-120 mm Hg. Samtidig var follikkelvæsken blitt samlet i rundbunnede sterile 14 ml falkerør. Under et stereomikroskop ble oocytt-cumulus-kompleksene (COC) identifisert, vasket og overført til befruktende globale totalmedier (LifeGlobal, Europa) og inkubert ved 6 % CO2 ved 37 °C inntil denudering.

4- Oocytt-denudering og scoring: COC-ene ble denudert ved å plassere dem i en 100 µ1 dråpe bufret medium som inneholder hyaluronidase-enzym 80 IE/ml (LifeGlobal, Europa) i 30 til 45 sekunder. Deretter ble oocyttene forsiktig aspirert inn og ut av en steril stripperpipette, noe som resulterte i fjerning av koronalcellene (25). Deretter ble en global total m/HEPES-buffer (LifeGlobal, Europa) brukt til å vaske de denuderte oocyttene. Et invertert mikroskop utstyrt med automatiske manipulatorer, Narishige, hot stage og Hoffman-optikk (Olympus 1x71) ble brukt for å vurdere oocyttenes modenhet. Vurderingen av oocyttmodning var som følger: modne oocytter i metafase II (MII) karakterisert ved ekstrudering av den polare kroppen, og umodne oocytter var enten i germinal vesikkelfase (GV) preget av en sentralt lokalisert germinal vesikkel eller i metafasen I (MI) karakterisert ved fraværet av både den polare kroppen og kimvesikkelen. Modne oocytter ble deretter inkubert i et kulturmedium i en Labotect-inkubator med 6 % Co2 ved 37 ºC frem til tidspunktet for den intracytoplasmatiske spermieinjeksjonen. I motsetning til dette ble umodne oocytter fra søsken inkubert i et kulturmedium (50 µ) med en konsentrasjon på 5000 spermatozoer/oocytter og plassert i Labotect-inkubatoren i 10-30 minutter til tidspunktet for spermseleksjon.

5- ICSI: Modne oocytter ble plassert i 10 µl mikrodråper av den globale totalen m/HEPES-buffer (LifeGlobal, Europa) dekket med 3 ml ren ekvilibrert mineralolje for ICSI.

I kontrollgruppen ble hver MII oocytt injisert med en konvensjonelt utvalgt sperm basert på morfologi og motilitet etter å ha blitt behandlet ved tetthetsgradientsentrifugering (DGC). I behandlingsgruppene ble imidlertid ZP-bundet sperm valgt fra overflaten av de umodne oocyttene ved bruk av en mikronål (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) og overført i en 10 % polyvinylpyrrolidon (PVP) løsning (SAGE, USA), immobilisert og deretter brukt til å injisere søsken MII oocytter. Prosedyren ble utført under et invertert mikroskop utstyrt med en holdepipette med lett undertrykk for håndtering av oocytten og en injeksjonsnål for å injisere sædcellene. De umodne oocyttene som ble brukt til sædseleksjon ble kastet. I alle gruppene ble injeksjonsnålen som inneholdt en enkelt sædcelle jevnt og sakte flyttet gjennom cytoplasmaet til MII-oocytten og falt 1 til 3 µl til midten av oocytten.

6- Utfallsmål: Alle embryologiske parametere (dvs. fertilisering, spaltning, blastocystdannelse og blastocystkvalitet) ble registrert og vurdert. Tegn på befruktning ble observert 16-18 timer etter ICSI. Videre, 48 og 72 timer etter ICSI, ble spaltningshastigheten vurdert. Blastocystdannelseshastigheten ble vurdert på dag fem etter ICSI. Embryoer med høykvalitets blastocystdannelse ble klassifisert i henhold til Gardners blastocystgraderingssystem. Dette systemet tildeler grader av ekspansjons- og klekkestatus i henhold til indre cellemasse (ICM) og trophectoderm (TE) kvalitet. Blastocyster av god kvalitet ble klassifisert som de med 6, 5, 4 eller 3AA, AB eller BA. Blastocyster av god kvalitet var de med 6, 5, 4 eller 3 BB.

7-Statistisk analyse Frekvensen av befruktning, spaltning, blastocystdannelse og høykvalitets blastocyster ble rapportert i prosent for hver gruppe. Karakteristika for mannlige og kvinnelige pasienter (alder, spermantall, spermmotilitet, spermmorfologi, antall hentede oocytter og antall modne og umodne oocytter) ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Student t-testen ble brukt for å sammenligne kontinuerlige variabler (befruktningshastigheter, spaltning, blastocystdannelse og blastocyster av høy kvalitet). Statistisk analyse ble utført med SPSS 13.0. P-verdi ≤ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.