Wyniki wykorzystania plemników związanych z warstwą przejrzystą niedojrzałych oocytów do wewnątrzcytoplazmatycznej iniekcji plemnika (ICSI)

Jakość wyselekcjonowanych plemników wykorzystywanych do intracytoplazmatycznej iniekcji spermy (ICSI) odgrywa szkodliwą rolę w jakości i rozwoju zarodka. W zapłodnieniu in vitro (IVF) oraz podczas podróży plemników przez żeński układ rozrodczy in vivo plemniki wchodzą w interakcję z osłoną przejrzystą (ZP) oocytu, co jest ostatnim etapem selekcji plemników przed wejściem do oocytu. ZP jest selektywny pod względem wiązania i może wiązać się z normalnie funkcjonującymi plemnikami, zwłaszcza tymi z prawidłowym regionem akrosomalnym. Według Liu i wsp. tylko 14% ruchliwych plemników u płodnych mężczyzn może wiązać się z ZP. Tylko te plemniki o stosunkowo normalnej wielkości i kształcie regionu akrosomalnego oraz plemniki bez lub z niewielką fragmentacją kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) mogą wiązać się z ZP i łączyć się z błoną plazmatyczną oocytu (oolemma), a tym samym są zdolne do zapłodnienia oocyt. Ludzkie plemniki różnią się wielkością, morfologią, integralnością DNA, ruchliwością, składem błony itp., co można zaobserwować nawet w tym samym ejakulacie. Faktem jest, że szczegółowe procedury selekcji plemników dotyczą plemników w żeńskich drogach rodnych w celu odfiltrowania plemników najwyższej jakości i umożliwienia jedynie małej subpopulacji plemników o najwyższej jakości dotarcia do miejsca zapłodnienia, w którym następuje kolejna selekcja plemników (tj. interakcja ZP).

Cechy plemników, które sprawiają, że zapłodnienie in vitro jest skuteczne, są nadal przedmiotem dyskusji. ICSI jest obecnie standardową praktyką w większości ośrodków technologii wspomaganego rozrodu (ART) na całym świecie i odpowiada za około 70% wszystkich zapłodnień in vitro. Rutynowa selekcja plemników do ICSI polega na subiektywnym wyborze plemników przez embriologa na podstawie ich ruchliwości i morfologii. Odbywa się to po analizie płynu nasiennego, który jest słabym narzędziem predykcyjnym męskiej płodności i nie wyraża zdolności zapłodnienia plemników. Założono, że naśladowanie naturalnej selekcji plemników może poprawić jakość wybranych plemników, a co za tym idzie wyniki kliniczne ICSI. W idealnym przypadku metoda selekcji plemników, która zmniejsza liczbę plemników do subpopulacji o potencjalnie najwyższej jakości, może poprawić zapłodnienie i jakość i rozwój zarodka oraz późniejsze wyniki kliniczne ICSI.

Na przestrzeni lat opracowano kilka technik selekcji plemników dla ICSI. Jednak techniki te zostały zaprojektowane w celu selekcji plemników na podstawie pojedynczego parametru nasienia (tj. ruchliwość, gęstość, sedymentacja, integralność jądrowa itp.) oraz pominięcie innych parametrów plemników związanych ze zdolnością do zapłodnienia komórki jajowej. Techniki selekcji plemników, takie jak pływanie, mikroprzepływy i wirowanie w gradiencie gęstości, dają populację wysoce ruchliwych plemników, ale nie naśladują rygorystycznej naturalnej selekcji plemników, która uwzględnia inne parametry plemników. Ponadto większość z tych metod wymaga wirowania, co może negatywnie wpływać na ojcowskie DNA i obniżać jakość nasienia poprzez zwiększenie reaktywnych form tlenu. Postępując zgodnie z tymi technikami, embriolog musi subiektywnie wybrać plemniki na podstawie ich ruchliwości i morfologii, co nie gwarantuje integralności DNA i jest potencjalnie czasochłonne.

Jedną z opracowanych metod selekcji plemników w celu względnego zduplikowania selekcji naturalnej jest oparta na wiązaniu kwasu hialuronowego (HA) płytka Fizjologiczne docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (PICSI)®. Warstwa wzgórka jajonośnego otaczająca komórkę jajową składa się głównie z HA. Istnieją jednak sprzeczne dane dotyczące wyników przy użyciu szalek PICSI. Ponadto wiązanie plemników z ZP obejmuje parametry inne niż HA, których nie ma w szalkach PICSI.

Interakcja plemnik-oocyt to wieloetapowy proces obejmujący interakcje fizyczne i molekularne. Obejmuje złożony i komplementarny proces oparty na receptorze/ligandzie między białkami powierzchniowymi ulegającymi ekspresji na ZP i nasieniu. Badania ujawniły kilka potencjalnych białek ZP, które, jak się uważa, odgrywają rolę w wiązaniu plemników. Głównym ich białkiem jest glikoproteina 3 zona pellucida (ZP3), której O-połączone łańcuchy oligosacharydowe wiążą się z nienaruszonym akrosomem plemnika i indukują reakcję akrosomalną.

Badaniem objęto 20 pacjentów poddawanych zabiegowi ICSI

Nasze kryteria włączenia obejmowały:

Wiek kobiet ≤ 38 lat. Wiek mężczyzny ≤ 50 lat. Posiadanie co najmniej jednego niedojrzałego oocytu (tj. pęcherzyka zarodkowego (GV) lub oocytu metafazy I (MI)) do inkubacji z plemnikami w celu zachowania dojrzałych plemników do ICSI.

Wykluczono co najmniej 10% ruchliwości plemników, a tym samym próbki plemników jąder. Pacjentów wybrano na podstawie procentowej fragmentacji DNA i rekrutowano tylko tych z ≤ 20%. Oocyty rodzeństwa podzielono losowo na grupę kontrolną i interwencyjną. Do oocytów grupy kontrolnej wstrzyknięto konwencjonalnie wybrane plemniki na podstawie morfologii i ruchliwości plemników. W przypadku grupy interwencyjnej jeden niedojrzały oocyt inkubowano z obliczoną objętością przetworzonego nasienia o stężeniu 500 000 ruchliwych plemników/oocyt w inkubatorze z dwutlenkiem węgla (CO2) przez 10 do 30 minut, a następnie sprawdzano, czy plemniki nie są związane pod odwróconym mikroskopem . Wybrano tylko związane plemniki o prawidłowej morfologii i przeniesiono do kropli poliwinylopirolidonu (PVP) w celu unieruchomienia, a następnie wstrzyknięto do cytoplazmy oocytów MII grup interwencyjnych.

Manipulacje kliniczne

1. Kontrolowana hiperstymulacja jajników (COH): Wszystkim pacjentkom codziennie wstrzykiwano podskórnie hormon folikulotropowy (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Stany Zjednoczone Ameryki) od 3 do 5 dnia cyklu miesiączkowego.

Pęcherzyki sprawdzono pod kątem osiągnięcia odpowiedniej średnicy (tj. 18-20 mm) oraz ich liczbę za pomocą ultrasonografu. Jeśli dwa lub więcej pęcherzyków osiągnęło odpowiednią średnicę, podawano domięśniowo czynnik wyzwalający (ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)) (Ovitrelle®; Merck Serono, Szwajcaria), aby pobudzić ostateczne dojrzewanie i wywołać owulację.

2-Przygotowanie nasienia: Po poinstruowaniu par męskich, aby powstrzymały się od czynności seksualnych przez 1 do 7 dni, pobrano próbki nasienia przez masturbację. Próbki umieszczano w temperaturze pokojowej na ciepłych płytkach lub inkubatorach w temperaturze 37°C, aż do ich upłynnienia i odnotowywano czas upłynniania.

Zarówno oceny makroskopowe, jak i mikroskopowe przeprowadzono, korzystając z podręcznika Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) z 2010 r. jako odniesienia. Następnie próbki traktowano jedną z następujących technik w zależności od czynnika męskiego:

W przypadku grup leczonych określoną objętość przygotowanego nasienia inkubowano wspólnie z niedojrzałym oocytem w naczyniu do wstrzykiwań zawierającym 10 µl mikrokropli pożywki globalnej (LifeGlobal, Europa) z 3 ml sterylnej, zrównoważonej warstwy oleju mineralnego w temperaturze 37°C z 6% CO2 przez 10-30 minut. Objętość zgodnie z równaniem:

x=(objętość peletki x 0,5 x 100)/(ruchliwość x liczba (po obróbce)) 3-Pozyskiwanie oocytów: Pobieranie oocytów przeprowadzono w przybliżeniu 36 godzin po podaniu czynnika wyzwalającego owulację. Pod kontrolą USG zastosowano igłę z pojedynczym prześwitem (Reproline, Niemcy) do zasysania pęcherzyków w celu szybkiego pobrania oocytów przy podciśnieniu 115-120 mm Hg. W tym samym czasie zebrano płyn pęcherzykowy do sterylnych okrągłodennych probówek typu Falcon o pojemności 14 ml. Pod mikroskopem stereoskopowym kompleksy oocyt-cumulus (COC) zostały zidentyfikowane, przemyte i przeniesione do globalnych pożywek nawozowych (LifeGlobal, Europa) i inkubowane w 6% CO2 w 37°C aż do denudacji.

4- Obnażenie i punktacja oocytów: COC obnażono przez umieszczenie ich w 100 µl kropli zbuforowanej pożywki zawierającej enzym hialuronidazę 80 IU/ml (LifeGlobal, Europa) na 30 do 45 sekund. Następnie oocyty delikatnie zasysano do środka i na zewnątrz sterylną pipetą do usuwania, co skutkowało usunięciem komórek wieńcowych (25). Następnie do przemycia obnażonych oocytów użyto globalnego całkowitego buforu HEPES (LifeGlobal, Europa). Do oceny dojrzałości oocytów wykorzystano mikroskop odwrócony wyposażony w automatyczne manipulatory, stolik Narishige, gorący stolik i optykę Hoffmana (Olympus 1x71). Ocena dojrzałości oocytów była następująca: dojrzałe oocyty w metafazie II (MII) charakteryzowały się ekstruzją ciałka kierunkowego, a niedojrzałe oocyty były albo w fazie pęcherzyka zarodkowego (GV) charakteryzującej się centralnie położonym pęcherzykiem zarodkowym lub w metafazie I (MI) charakteryzuje się brakiem ciała kierunkowego i pęcherzyka zarodkowego. Dojrzałe oocyty następnie inkubowano w pożywce hodowlanej w inkubatorze Labotect z 6% Co2 w temperaturze 37 ºC do czasu wstrzyknięcia plemnika do cytoplazmy. Natomiast niedojrzałe oocyty rodzeństwa inkubowano w pożywce hodowlanej (50 µ) o stężeniu 5000 plemników/oocyt i umieszczano w inkubatorze Labotect na 10-30 minut do czasu selekcji plemników.

5- ICSI: Dojrzałe oocyty umieszczono w 10 µl mikrokropli całkowitego buforu w/HEPES (LifeGlobal, Europa) pokrytego 3 ml czystego, zrównoważonego oleju mineralnego do ICSI.

W grupie kontrolnej każdemu oocytowi MII wstrzyknięto konwencjonalnie wybrane plemniki w oparciu o morfologię i ruchliwość po przetworzeniu przez wirowanie w gradiencie gęstości (DGC). Jednak w grupach leczonych plemniki związane z ZP wybierano z powierzchni niedojrzałych oocytów za pomocą mikroigły (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, USA) i przenoszono w 10% roztworze poliwinylopirolidonu (PVP) (SAGE, USA), unieruchomiono, a następnie użyto do wstrzyknięcia oocytów rodzeństwa MII. Procedurę przeprowadzono pod mikroskopem odwróconym wyposażonym w pipetę podtrzymującą z lekkim podciśnieniem do manipulowania komórką jajową oraz igłę iniekcyjną do wstrzykiwania plemnika. Niedojrzałe oocyty użyte do selekcji plemników odrzucono. We wszystkich grupach igła iniekcyjna zawierająca pojedynczy plemnik była stabilnie i powoli przesuwana przez cytoplazmę oocytu MII i opadała 1 do 3 µl do środka oocytu.

6- Miary wyniku: Wszystkie parametry embriologiczne (tj. zapłodnienie, bruzdkowanie, powstawanie blastocysty i jakość blastocysty) rejestrowano i oceniano. Oznaki zapłodnienia obserwowano 16-18 godzin po ICSI. Ponadto, 48 i 72 godziny po ICSI oceniono szybkość cięcia. Szybkość tworzenia blastocyst oceniano w piątym dniu po ICSI. Zarodki z formacją blastocysty wysokiej jakości sklasyfikowano zgodnie z systemem klasyfikacji blastocysty Gardnera. System ten przypisuje stopnie statusu ekspansji i wylęgu zgodnie z masą komórek wewnętrznych (ICM) i jakością trofektodermy (TE). Dobrej jakości blastocysty zostały sklasyfikowane jako te z 6, 5, 4 lub 3AA, AB lub BA. Blastocysty dobrej jakości to te z 6, 5, 4 lub 3 BB.

7-Analiza statystyczna Wskaźniki zapłodnienia, rozszczepiania, tworzenia blastocyst i wysokiej jakości blastocyst podano jako wartości procentowe dla każdej grupy. Charakterystykę pacjentów płci męskiej i żeńskiej (wiek, liczba plemników, ruchliwość plemników, morfologia plemników, liczba pobranych oocytów oraz liczba dojrzałych i niedojrzałych oocytów) wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Test t-Studenta zastosowano do porównania zmiennych ciągłych (współczynników zapłodnienia, rozszczepiania, tworzenia blastocyst i wysokiej jakości blastocyst). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą SPSS 13.0. Wartość P ≤ 0,05 uznano za istotną statystycznie.