Resultaat van het gebruik van sperma gebonden aan de Zona Pellucida van onrijpe eicellen voor intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)

De kwaliteit van het geselecteerde sperma dat wordt gebruikt voor intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) speelt een nadelige rol in de embryonale kwaliteit en ontwikkeling. Bij in-vitrofertilisatie (IVF) en tijdens de reis van het sperma door het vrouwelijke voortplantingsstelsel in vivo, interageert het sperma met de zona pellucida (ZP) van de eicel, wat de laatste fase is van spermaselectie voordat het de eicel binnengaat. De ZP is selectief wat betreft binding en kan zich binden aan normaal functionerende zaadcellen, vooral die met een normaal acrosomaal gebied. Volgens Liu et al. kan slechts 14% van de beweeglijke spermatozoa bij vruchtbare mannen zich binden aan de ZP. Alleen die spermatozoa met relatief normale grootte en vorm van het acrosomale gebied en die met geen of lage deoxyribonucleïnezuur (DNA) fragmentatie kunnen binden aan en de ZP en fuseren met het plasmamembraan van de oöcyt (oolemma) en zijn dus in staat om de eicel. Menselijk sperma varieert in grootte, morfologie, DNA-integriteit, beweeglijkheid, membraansamenstelling, enz., en dit kan zelfs in hetzelfde ejaculaat worden waargenomen. Het is een gegeven feit dat grondige spermaselectieprocedures spermatozoa in het vrouwelijke geslachtsorgaan overkomen om superieur sperma te filteren en slechts een kleine subpopulatie van spermatozoa met superieure kwaliteit de plaats van bevruchting te laten bereiken waar een andere spermaselectie plaatsvindt (d.w.z. ZP-interactie).

Over de eigenschappen van sperma die in-vitrofertilisatie effectief maken, wordt nog steeds gedebatteerd. ICSI is nu de standaardpraktijk voor de meeste centra voor geassisteerde voortplantingstechnologieën (ART) wereldwijd en is goed voor ongeveer 70% van alle in-vitrofertilisatie. De routinematige selectie van spermatozoa voor ICSI hangt af van de subjectieve selectie van sperma door een embryoloog op basis van hun beweeglijkheid en morfologie. Het wordt gedaan na een analyse van de zaadvloeistof, wat een slecht voorspellend instrument is voor de mannelijke vruchtbaarheid en het bevruchtingsvermogen van het sperma niet uitdrukt. Het was ervan uitgegaan dat het nabootsen van de natuurlijke spermaselectie de kwaliteit van geselecteerde spermatozoa en daarmee de klinische resultaten van ICSI zou kunnen verbeteren. Idealiter kan een spermaselectiemethode die het aantal spermatozoa reduceert tot een subpopulatie met potentieel de hoogste kwaliteit, de bevruchting en de kwaliteit en ontwikkeling van het embryo en de daaropvolgende klinische resultaten van ICSI verbeteren.

Voor ICSI zijn in de loop der jaren verschillende technieken voor spermaselectie ontwikkeld. Deze technieken zijn echter ontworpen om sperma te selecteren op basis van een enkele spermaparameter (d.w.z. beweeglijkheid, dichtheid, sedimentatie, kernintegriteit, enz.) en het negeren van andere spermaparameters die verband houden met het vermogen om de eicel te bevruchten. Spermaselectietechnieken zoals swim-up, microfluïdica en dichtheidsgradiëntcentrifugatie leveren een populatie van zeer beweeglijk sperma op, maar slagen er niet in de rigoureuze natuurlijke spermaselectie na te bootsen die rekening houdt met andere spermaparameters. Bovendien vereisen de meeste van deze methoden centrifugatie, wat een negatief effect kan hebben op het vaderlijke DNA en de kwaliteit van het sperma vermindert door de reactieve zuurstofsoorten te verhogen. Door deze technieken te volgen, moet een embryoloog sperma subjectief selecteren op basis van hun beweeglijkheid en morfologie, wat de DNA-integriteit niet garandeert en mogelijk tijdrovend is.

Een van de ontwikkelde methoden voor spermaselectie om de natuurlijke selectie relatief te dupliceren, zijn de op hyaluronzuur (HA) binding gebaseerde fysiologische intracytoplasmatische sperma-injectie (PICSI)®-schaaltjes. De cumulus oophorus-laag rond de eicel bestaat voornamelijk uit HA. Er zijn echter tegenstrijdige gegevens over de resultaten met behulp van PICSI-schotels. Bovendien omvat sperma-ZP-binding andere parameters dan HA die niet voorkomen in PICSI-schotels.

Sperma-eicelinteractie is een proces dat uit meerdere stappen bestaat, waarbij fysieke en moleculaire interacties betrokken zijn. Het omvat een complex en complementair receptor/ligand-gebaseerd proces tussen de oppervlakte-eiwitten die tot expressie worden gebracht op de ZP en het sperma. Onderzoek heeft verschillende ZP-eiwitkandidaten onthuld waarvan wordt aangenomen dat ze een rol spelen bij het binden van sperma. Het belangrijkste eiwit hiervan is het zona pellucida-glycoproteïne 3 (ZP3), waarvan de O-gekoppelde oligosaccharideketens binden aan een acrosoom-intact sperma en een acrosomale reactie induceren.

De studie bestond uit 20 patiënten die ICSI ondergingen

Onze opnamecriteria omvatten:

Vrouwelijke leeftijd ≤ 38 jaar oud. Leeftijd man ≤ 50 jaar. Het hebben van ten minste één onrijpe eicel (d.w.z. germinal vesicle (GV) of Metaphase I (MI) eicel) voor incubatie met sperma om volwassen exemplaren voor ICSI te bewaren.

Ten minste 10% spermamotiliteit en dus testiculaire spermamonsters werden uitgesloten. De patiënten werden geselecteerd op basis van het percentage DNA-fragmentatie en alleen degenen met ≤ 20% werden gerekruteerd. Oöcyten van broers en zussen werden willekeurig verdeeld in een controlegroep en een interventiegroep. Eicellen van de controlegroep werden geïnjecteerd met conventioneel geselecteerde spermatozoa op basis van spermamorfologie en beweeglijkheid. Voor de interventiegroep werd één onrijpe eicel gedurende 10 tot 30 minuten geïncubeerd met een berekend volume van het verwerkte sperma met een concentratie van 500.000 beweeglijke zaadcellen/eicellen in een koolstofdioxide-incubator (CO2) en vervolgens gecontroleerd op gebonden sperma onder een omgekeerde microscoop . Alleen gebonden zaadcellen met een normale morfologie werden geselecteerd en overgebracht naar een polyvinylpyrrolidon (PVP)-druppel voor immobilisatie en vervolgens geïnjecteerd in het cytoplasma van de MII-oöcyten van de interventiegroepen.

Klinische manipulaties

1. Gecontroleerde ovariële hyperstimulatie (COH): Alle vrouwelijke patiënten werden dagelijks geïnjecteerd met een onderhuids follikelstimulerend hormoon (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Verenigde Staten van Amerika) van de 3e tot de 5e dag van de menstruatiecyclus.

De follikels werden gecontroleerd op het bereiken van de juiste diameter (d.w.z. 18-20 mm) en voor hun aantal met behulp van een ultrasoon apparaat. Als twee of meer follikels de juiste diameter bereikten, werd een trigger (humaan choriongonadotrofine (hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Zwitserland) intramusculair toegediend om de uiteindelijke rijping aan te moedigen en ovulatie te induceren.

2-Spermavoorbereiding: nadat mannelijke paren de instructie hadden gekregen om zich gedurende 1 tot 7 dagen te onthouden van seksuele activiteiten, werden spermamonsters verzameld door masturbatie. Monsters werden bij kamertemperatuur op warme platen of incubatoren bij 37 °C geplaatst totdat ze vloeibaar waren geworden en het tijdstip van vloeibaar worden werd geregistreerd.

Zowel macroscopische als microscopische beoordelingen werden uitgevoerd met behulp van de handleiding van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) uit 2010 als referentie. Vervolgens werden monsters behandeld met een van de volgende technieken, afhankelijk van de mannelijke factor:

Voor de behandelingsgroepen werd een specifiek volume van het bereide sperma samen met een onrijpe oöcyt geïncubeerd in een injectieschaal met 10 µl microdruppels globale media (LifeGlobal, Europa) met 3 ml steriele geëquilibreerde minerale olie-overlay bij 37 °C met 6% CO2 gedurende 10-30 minuten. Het volume volgens de vergelijking:

x=(pelletvolume x 0,5 x 100)/(motiliteit x aantal (na verwerking)) 3-Oöcyten ophalen: Het ophalen van eicellen werd ongeveer 36 uur na toediening van de ovulatietrigger uitgevoerd. Onder ultrasone begeleiding was een naald met één lumen (Reproline, Duitsland) gebruikt om de follikels op te zuigen voor een snelle opname van eicellen met een negatieve druk van 115-120 mm Hg. Tegelijkertijd was het folliculaire vocht opgevangen in steriele 14 ml Falcon-buisjes met ronde bodem. Onder een stereomicroscoop werden de eicel-cumuluscomplexen (COC's) geïdentificeerd, gewassen en overgebracht naar bemestende globale totale media (LifeGlobal, Europa) en geïncubeerd bij 6% CO2 bij 37°C tot ontleding.

4- Oöcyt denudatie en scoren: De COC's werden gedenudeerd door ze gedurende 30 tot 45 seconden in een druppel van 100 µl gebufferd medium met hyaluronidase-enzym 80 IU/ml (LifeGlobal, Europa) te plaatsen. Vervolgens werden de oöcyten voorzichtig in en uit gezogen met een steriele stripperpipet, wat resulteerde in de verwijdering van de coronale cellen (25). Daarna werd een wereldwijd totaal met HEPES-buffer (LifeGlobal, Europa) gebruikt om de ontblote oöcyten te wassen. Een omgekeerde microscoop uitgerust met automatische manipulatoren, Narishige, hot stage en Hoffman-optica (Olympus 1x71) werd gebruikt om de rijpheid van de oöcyten te beoordelen. De beoordeling van de eicelrijping was als volgt: rijpe eicellen in de metafase II (MII), gekenmerkt door de extrusie van het poollichaampje, en onrijpe eicellen bevonden zich in de kiemblaasjesfase (GV), gekenmerkt door een centraal gelegen kiemblaasje, of in de metafase. I (MI) gekenmerkt door de afwezigheid van zowel het poollichaampje als het kiemblaasje. Rijpe oöcyten werden vervolgens geïncubeerd in een kweekmedium in een Labotect-incubator met 6% Co2 bij 37 ºC tot het moment van de intracytoplasmatische sperma-injectie. Daarentegen werden onrijpe oöcyten van broers en zussen geïncubeerd in een kweekmedium (50 µ) met een concentratie van 5000 spermatozoa/oöcyt en gedurende 10-30 minuten in de Labotect-incubator geplaatst tot het moment van spermaselectie.

5- ICSI: rijpe oöcyten werden in 10 µl microdruppels van de globale totale w/HEPES-buffer (LifeGlobal, Europa) bedekt met 3 ml pure geëquilibreerde minerale olie voor ICSI geplaatst.

In de controlegroep werd elke MII-oöcyt geïnjecteerd met een conventioneel geselecteerd sperma op basis van morfologie en beweeglijkheid na verwerking door dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC). In de behandelingsgroepen werden echter ZP-gebonden spermacellen geselecteerd uit het oppervlak van de onrijpe oöcyten door middel van een micronaald (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, VS) en overgebracht in een 10% polyvinylpyrrolidon (PVP)-oplossing (SAGE, VS), geïmmobiliseerd en vervolgens gebruikt om MII-eicellen van broer of zus te injecteren. De procedure werd uitgevoerd onder een omgekeerde microscoop die was uitgerust met een houderpipet met lichte negatieve druk voor het hanteren van de eicel en een injectienaald voor het injecteren van het sperma. De onrijpe oöcyten die voor spermaselectie werden gebruikt, werden weggegooid. In alle groepen werd de injectienaald met een enkel sperma gestaag en langzaam door het cytoplasma van de MII-eicel bewogen en 1 tot 3 µl naar het midden van de eicel gedropt.

6- Uitkomstmaten: alle embryologische parameters (d.w.z. bevruchting, splitsing, blastocystvorming en blastocystkwaliteit) werden geregistreerd en beoordeeld. Tekenen van bevruchting werden 16-18 uur na ICSI waargenomen. Bovendien werd 48 en 72 uur na ICSI de splitsingssnelheid beoordeeld. De snelheid van vorming van blastocysten werd beoordeeld op dag vijf na ICSI. Embryo's met hoogwaardige blastocystvorming werden geclassificeerd volgens het classificatiesysteem voor blastocysten van Gardner. Dit systeem kent graden van de expansie- en uitkomststatus toe op basis van de binnenste celmassa (ICM) en de kwaliteit van het trophectoderm (TE). Blastocysten van goede kwaliteit werden geclassificeerd als die met 6, 5, 4 of 3AA, AB of BA. Blastocysten van redelijke kwaliteit waren die met 6, 5, 4 of 3 BB.

7-Statistische analyse De percentages van bevruchting, splitsing, blastocystvorming en hoogwaardige blastocysten werden gerapporteerd als percentages voor elke groep. Kenmerken van mannelijke en vrouwelijke patiënten (leeftijd, aantal zaadcellen, spermamotiliteit, spermamorfologie, aantal teruggevonden oöcyten en aantal volwassen en onrijpe oöcyten) werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De Student t-test werd gebruikt om continue variabelen (bevruchtingspercentages, splitsing, blastocystvorming en hoogwaardige blastocysten) te vergelijken. Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS 13.0. P-waarde ≤ 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.