Результат использования спермы, связанной с блестящей зоной незрелых ооцитов, для интрацитоплазматической инъекции спермы (ИКСИ)

Качество отобранной спермы, используемой для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ), играет пагубную роль в качестве и развитии эмбриона. При экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) и во время путешествия сперматозоидов по женским половым путям in vivo сперматозоиды взаимодействуют с блестящей оболочкой (ZP) ооцита, что является последней стадией отбора сперматозоидов перед попаданием в ооцит. ZP является селективным в отношении связывания и может связываться с нормально функционирующими сперматозоидами, особенно с нормальным акросомальным участком. По данным Liu et al., только 14% подвижных сперматозоидов у фертильных мужчин могут связываться с ZP. Только сперматозоиды с относительно нормальным размером и формой акросомальной области и сперматозоиды с нулевой или низкой фрагментацией дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) могут связываться с ZP и сливаться с плазматической мембраной ооцита (оолемма) и, таким образом, способны оплодотворять ооцит. ооцит. Сперматозоиды человека различаются по размеру, морфологии, целостности ДНК, подвижности, составу мембран и т. д., и это можно наблюдать даже в одном и том же эякуляте. Это факт, что тщательные процедуры отбора сперматозоидов применяются к сперматозоидам в женских половых путях для фильтрации сперматозоидов высшего качества и позволяют лишь небольшой субпопуляции сперматозоидов высшего качества достичь места оплодотворения, где происходит отбор другого сперматозоида (т.е. взаимодействие ЗП).

Свойства сперматозоидов, которые делают оплодотворение in vitro эффективным, до сих пор обсуждаются. В настоящее время ИКСИ является стандартной практикой для большинства центров вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) по всему миру, и на ее долю приходится примерно 70% всех экстракорпоральных оплодотворений. Обычный отбор сперматозоидов для ИКСИ зависит от субъективного отбора эмбриологом сперматозоидов на основе их подвижности и морфологии. Это делается после анализа семенной жидкости, который является плохим прогностическим инструментом мужской фертильности и не отражает способность сперматозоидов к оплодотворению. Предполагалось, что имитация естественного отбора сперматозоидов может улучшить качество отобранных сперматозоидов и, следовательно, клинические результаты ИКСИ. В идеале метод отбора сперматозоидов, который уменьшает количество сперматозоидов до субпопуляции потенциально самого высокого качества, может улучшить оплодотворение и качество эмбриона, а также его развитие и последующие клинические результаты ИКСИ.

За прошедшие годы было разработано несколько методов отбора сперматозоидов для ИКСИ. Однако эти методы были разработаны для отбора сперматозоидов на основе одного параметра спермы (т.е. подвижность, плотность, седиментация, целостность ядер и т.д.) и игнорирование других параметров сперматозоидов, связанных со способностью оплодотворять яйцеклетку. Методы отбора сперматозоидов, такие как плавание, микрофлюидика и центрифугирование в градиенте плотности, дают популяцию высокоподвижных сперматозоидов, но не могут имитировать строгий естественный отбор сперматозоидов, учитывающий другие параметры сперматозоидов. Более того, большинство этих методов требуют центрифугирования, которое может негативно повлиять на отцовскую ДНК и снизить качество спермы за счет увеличения количества активных форм кислорода. Следуя этим методам, эмбриолог должен субъективно отбирать сперматозоиды на основе их подвижности и морфологии, что не гарантирует целостности ДНК и потенциально требует много времени.

Одним из разработанных методов отбора сперматозоидов для относительного дублирования естественного отбора являются чашки с физиологической интрацитоплазматической инъекцией сперматозоидов (PICSI)® на основе связывания гиалуроновой кислоты (HA). Слой кумулюса приофора, окружающий ооцит, состоит в основном из ГК. Однако имеются противоречивые данные о результатах использования чашек PICSI. Более того, связывание спермы с ZP включает параметры, отличные от HA, которые не представлены в чашках PICSI.

Взаимодействие сперматозоидов с ооцитами представляет собой многоэтапный процесс, включающий физические и молекулярные взаимодействия. Он включает сложный и комплементарный процесс, основанный на рецепторе/лиганде, между поверхностными белками, экспрессируемыми на ZP, и спермой. Исследования выявили несколько кандидатов в белки ZP, которые, как постулируется, играют роль в связывании сперматозоидов. Основным белком из них является гликопротеин 3 пеллюцидной зоны (ZP3), чьи О-связанные олигосахаридные цепи связываются с интактным акросомой сперматозоидом и вызывают акросомную реакцию.

В исследовании приняли участие 20 пациентов, перенесших ИКСИ.

Наши критерии включения включали:

Женский возраст ≤ 38 лет. Возраст мужчин ≤ 50 лет. Наличие хотя бы одного незрелого ооцита (т.е. зародышевый пузырек (GV) или ооцит метафазы I (MI) для инкубации со спермой для сохранения зрелых сперматозоидов для ИКСИ.

По крайней мере, 10% подвижных сперматозоидов и, следовательно, образцы сперматозоидов из яичек были исключены. Пациенты были отобраны на основе процента фрагментации ДНК, и были набраны только пациенты с ≤ 20%. Ооциты братьев и сестер были случайным образом разделены на контрольную и экспериментальную группы. В ооциты контрольной группы инъецировали сперматозоиды, отобранные традиционно на основе морфологии и подвижности сперматозоидов. В экспериментальной группе один незрелый ооцит инкубировали с расчетным объемом обработанной спермы с концентрацией 500 000 подвижных сперматозоидов/ооцит в инкубаторе с диоксидом углерода (CO2) в течение 10–30 минут, а затем проверяли наличие связанных сперматозоидов под инвертированным микроскопом. . Только связанные сперматозоиды с нормальной морфологией были отобраны и перенесены в каплю поливинилпирролидона (ПВП) для иммобилизации, а затем введены в цитоплазму ооцитов MII групп вмешательства.

Клинические манипуляции

1. Контролируемая гиперстимуляция яичников (КГЯ). Всем пациенткам ежедневно вводили подкожно фолликулостимулирующий гормон (Гн, Гонал-Ф, Merck Serono, США) с 3-го по 5-й день менструального цикла.

Фолликулы проверяли на предмет достижения соответствующего диаметра (т.е. 18-20 мм) и для их количества с помощью ультразвукового аппарата. Если два или более фолликула достигали соответствующего диаметра, внутримышечно вводили триггер (хорионический гонадотропин человека (ХГЧ)) (Ovitrelle®; Merck Serono, Швейцария) для стимулирования окончательного созревания и индукции овуляции.

2-Подготовка спермы: после того, как мужские пары были проинструктированы воздерживаться от сексуальной активности в течение 1-7 дней, образцы спермы были собраны путем мастурбации. Образцы помещали при комнатной температуре на теплые чашки или инкубаторы при 37ºC до тех пор, пока они не разжижались, и регистрировали время разжижения.

Как макроскопические, так и микроскопические оценки проводились с использованием руководства Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2010 г. в качестве эталона. Затем образцы обрабатывали по одной из следующих методик в зависимости от мужского фактора:

В экспериментальных группах определенный объем подготовленной спермы инкубировали совместно с незрелым ооцитом в чашке для инъекций, содержащей 10 мкл микрокапель глобальной среды (LifeGlobal, Европа) с 3 мл стерильного уравновешенного слоя минерального масла при 37 °C. с 6 % CO2 в течение 10-30 минут. Объем по уравнению:

х=(объем пеллет х 0,5 х 100)/(подвижность х количество (после обработки)) 3-Извлечение ооцитов: Извлечение ооцитов проводили примерно через 36 часов после введения триггера овуляции. Под контролем УЗИ однопросветной иглой (Reproline, Германия) аспирировали фолликулы для быстрого забора ооцитов с отрицательным давлением 115-120 мм рт.ст. Параллельно собирали фолликулярную жидкость в круглодонные стерильные пробирки Falcon объемом 14 мл. Под стереомикроскопом ооцит-кумулюсные комплексы (КОК) идентифицировали, промывали и переносили на оплодотворяющую глобальную тотальную среду (LifeGlobal, Европа) и инкубировали при 6% СО2 при 37°С до оголения.

4. Денудация ооцитов и оценка: КОК оголяли, помещая их в 100 мкл капли буферной среды, содержащей фермент гиалуронидазу 80 МЕ/мл (LifeGlobal, Европа) на 30–45 секунд. Затем ооциты аккуратно аспирировали стерильной стрипперной пипеткой, что привело к удалению коронковых клеток (25). После этого для промывания денудированных ооцитов использовали глобальный тотал с буфером HEPES (LifeGlobal, Европа). Для оценки зрелости ооцитов использовали инвертированный микроскоп, оснащенный автоматическими манипуляторами, Наришиге, горячим столиком и оптикой Хоффмана (Olympus 1x71). Оценка созревания ооцитов была следующей: зрелые ооциты находились в метафазе II (MII), характеризующейся экструзией полярного тельца, а незрелые ооциты находились либо в фазе зародышевых везикул (GV), характеризующейся центрально расположенным зародышевым везикулой, либо в метафазе. I (МИ) характеризуется отсутствием как полярного тельца, так и зародышевого пузырька. Затем зрелые ооциты инкубировали в культуральной среде в инкубаторе Labotect с 6% Co2 при 37 ºC до момента интрацитоплазматической инъекции спермы. Напротив, незрелые ооциты сиблинга инкубировали в культуральной среде (50 мкл) с концентрацией 5000 сперматозоидов/ооцит и помещали в инкубатор Labotect на 10-30 минут до времени отбора сперматозоидов.

5- ИКСИ: Зрелые ооциты помещали в 10 мкл микрокапель общего раствора с буфером HEPES (LifeGlobal, Европа), покрытых 3 мл чистого уравновешенного минерального масла для ИКСИ.

В контрольной группе в каждый ооцит MII вводили традиционно отобранную сперму на основе морфологии и подвижности после обработки центрифугированием в градиенте плотности (DGC). Однако в экспериментальных группах сперматозоиды, связанные с ZP, отбирали с поверхности незрелых ооцитов с помощью микроиглы (Sunlight Medical, Джексонвилл, Флорида, США) и переносили в 10% раствор поливинилпирролидона (ПВП) (SAGE, США), иммобилизовали, а затем использовали для инъекции родственных ооцитов MII. Процедуру проводили под инвертированным микроскопом, снабженным удерживающей пипеткой с небольшим отрицательным давлением для работы с ооцитом и инъекционной иглой для введения спермы. Незрелые ооциты, использованные для отбора сперматозоидов, отбрасывали. Во всех группах игла для инъекций, содержащая один сперматозоид, постоянно и медленно перемещалась через цитоплазму ооцита MII и опускалась на 1–3 мкл к центру ооцита.

6- Показатели результатов: все эмбриологические параметры (т.е. оплодотворение, дробление, образование бластоцисты и качество бластоцисты) регистрировали и оценивали. Признаки оплодотворения наблюдались через 16-18 часов после ИКСИ. Кроме того, через 48 и 72 ч после ИКСИ оценивали скорость расщепления. Скорость образования бластоцист оценивали на пятый день после ИКСИ. Эмбрионы с качественным образованием бластоцист классифицировали в соответствии с системой классификации бластоцист Гарднера. Эта система присваивает степени расширения и статуса вылупления в соответствии с внутренней клеточной массой (ICM) и качеством трофэктодермы (TE). Бластоцисты хорошего качества были классифицированы как имеющие 6, 5, 4 или 3AA, AB или BA. Бластоцисты удовлетворительного качества имели размер 6, 5, 4 или 3 BB.

7-Статистический анализ. Показатели оплодотворения, дробления, образования бластоцист и высококачественных бластоцист представлены в процентах для каждой группы. Характеристики пациентов мужского и женского пола (возраст, количество сперматозоидов, подвижность сперматозоидов, морфология сперматозоидов, количество извлеченных ооцитов, количество зрелых и незрелых ооцитов) выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Для сравнения непрерывных переменных (скорость оплодотворения, дробление, образование бластоцист и высококачественные бластоцисты) использовали t-критерий Стьюдента. Статистический анализ был выполнен с помощью SPSS 13.0. Значение P ≤ 0,05 считалось статистически значимым.