Resultado do uso de espermatozoides ligados à zona pelúcida de oócitos imaturos para injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)

A qualidade do esperma selecionado usado para injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) desempenha um papel prejudicial na qualidade e no desenvolvimento embrionário. Na fertilização in vitro (FIV) e durante a jornada do esperma pelo trato reprodutivo feminino in vivo, o esperma interage com a zona pelúcida (ZP) do oócito, que é o último estágio de seleção do esperma antes de entrar no oócito. A ZP é seletiva em relação à ligação e pode se ligar a espermatozoides com funcionamento normal, especialmente aqueles com região acrossômica normal. Segundo Liu et al., apenas 14% dos espermatozóides móveis em homens férteis podem se ligar ao ZP. Somente os espermatozoides com tamanho e forma relativamente normais da região acrossomal e aqueles com nenhuma ou baixa fragmentação do ácido desoxirribonucléico (DNA) podem se ligar à ZP e se fundir com a membrana plasmática do oócito (oolema) e, portanto, são capazes de fertilizar o oócito. Os espermatozóides humanos variam em tamanho, morfologia, integridade do DNA, motilidade, composição da membrana, etc., e isso pode ser observado até mesmo no mesmo ejaculado. É um fato que os procedimentos completos de seleção de espermatozóides recaem sobre os espermatozóides no trato genital feminino para filtrar espermatozóides superiores e permitir que apenas uma pequena subpopulação de espermatozóides com qualidade superior alcance o local de fertilização onde ocorre outra seleção de espermatozóides (ou seja, interação ZP).

As características do esperma que tornam a fertilização in vitro eficaz ainda são debatidas. A ICSI é agora a prática padrão para a maioria dos centros de tecnologias de Reprodução Assistida (ART) em todo o mundo e é responsável por aproximadamente 70% de toda a fertilização in vitro. A seleção rotineira de espermatozóides para ICSI depende de um embriologista selecionar subjetivamente os espermatozoides com base em sua motilidade e morfologia. É feito após uma análise do fluido seminal, que é uma ferramenta preditiva pobre da fertilidade masculina e não expressa a capacidade de fertilização do esperma. Ele assumiu que imitar a seleção natural do esperma pode melhorar a qualidade dos espermatozóides selecionados e, portanto, os resultados clínicos da ICSI. Idealmente, um método de seleção de esperma que reduza o número de espermatozóides a uma subpopulação com potencialmente a mais alta qualidade pode melhorar a fertilização e a qualidade e desenvolvimento do embrião e os resultados clínicos subsequentes da ICSI.

Ao longo dos anos, várias técnicas de seleção de esperma foram desenvolvidas para ICSI. No entanto, essas técnicas foram projetadas para selecionar espermatozoides com base em um único parâmetro espermático (ou seja, motilidade, densidade, sedimentação, integridade nuclear, etc.) e ignorando outros parâmetros espermáticos relacionados à capacidade de fertilizar o oócito. Técnicas de seleção de esperma, como swim-up, microfluídica e centrifugação de gradiente de densidade, produzem uma população de esperma altamente móvel, mas falham em imitar a rigorosa seleção natural de esperma que considera outros parâmetros de esperma. Além disso, a maioria desses métodos requer centrifugação, o que pode afetar negativamente o DNA paterno e reduzir a qualidade do esperma por aumentar as espécies reativas de oxigênio. Seguindo essas técnicas, um embriologista deve selecionar subjetivamente o esperma com base em sua motilidade e morfologia, o que não garante a integridade do DNA e é potencialmente demorado.

Um dos métodos de seleção de espermatozoides desenvolvidos para duplicar relativamente a seleção natural são as placas de injeção intracitoplasmática de espermatozoides (PICSI)® baseadas na ligação do ácido hialurônico (HA). A camada de cumulus oophorus que envolve o oócito consiste principalmente de HA. No entanto, há dados conflitantes sobre os resultados usando pratos PICSI. Além disso, a ligação do esperma-ZP compreende outros parâmetros além do HA que não são apresentados nas placas PICSI.

A interação espermatozóide-oócito é um processo de várias etapas envolvendo interações físicas e moleculares. Envolve um processo baseado em receptor/ligante complexo e complementar entre as proteínas de superfície expressas na ZP e o esperma. A pesquisa revelou vários candidatos à proteína ZP postulados para desempenhar um papel na ligação do esperma. A principal delas é a glicoproteína 3 da zona pelúcida (ZP3), cujas cadeias oligossacarídicas ligadas a O ligam-se a um espermatozoide com acrossoma intacto e induzem uma reação acrossômica.

O estudo consistiu de 20 pacientes submetidos a ICSI

Nossos critérios de inclusão incluíram:

Idade feminina ≤ 38 anos. Idade do sexo masculino ≤ 50 anos. Ter pelo menos um ovócito imaturo (i.e. vesícula germinativa (GV) ou metáfase I (MI) oócito) para incubação com esperma para preservar os maduros para ICSI.

Pelo menos 10% de motilidade espermática e, portanto, amostras de esperma testicular foram excluídas. Os pacientes foram selecionados com base na porcentagem de fragmentação do DNA e apenas aqueles com ≤ 20% foram recrutados. Oócitos irmãos foram divididos aleatoriamente em um grupo controle e um grupo de intervenção. Oócitos do grupo controle foram injetados com espermatozoides selecionados convencionalmente com base na morfologia e motilidade espermática. Para o grupo de intervenção, um oócito imaturo foi incubado com um volume calculado de sêmen processado com uma concentração de 500.000 espermatozóides/oócitos móveis em uma incubadora de dióxido de carbono (CO2) por 10 a 30 minutos e depois verificado quanto a espermatozóides ligados sob um microscópio invertido . Apenas os espermatozóides ligados com morfologia normal foram selecionados e transferidos para uma gota de polivinilpirrolidona (PVP) para imobilização e, em seguida, injetados no citoplasma dos oócitos MII dos grupos de intervenção.

manipulações clínicas

1. Hiperestimulação ovariana controlada (COH): Todas as pacientes do sexo feminino foram injetadas diariamente com hormônio folículo-estimulante subcutâneo (Gn, Gonal-F, Merck Serono, Estados Unidos da América) do 3º ao 5º dia do ciclo menstrual.

Os folículos foram verificados para atingir o diâmetro apropriado (ou seja, 18-20 mm) e pelo seu número usando um aparelho de ultrassom. Se dois ou mais folículos atingissem o diâmetro apropriado, um gatilho (gonadotrofina coriônica humana (hCG)), (Ovitrelle®; Merck Serono, Suíça) era administrado por via intramuscular para estimular a maturação final e induzir a ovulação.

2-Preparação do esperma: Após os casais do sexo masculino terem sido instruídos a abster-se de atividades sexuais por 1 a 7 dias, amostras de sêmen foram coletadas por masturbação. As amostras foram colocadas em temperatura ambiente em placas aquecidas ou incubadoras a 37ºc até que fossem liquefeitas e o tempo de liquefação foi registrado.

As avaliações macroscópicas e microscópicas foram realizadas usando o manual da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2010 como referência. Em seguida, as amostras foram tratadas por uma das seguintes técnicas, dependendo do fator masculino:

Para os grupos de tratamento, um volume específico do sêmen preparado foi co-incubado com um oócito imaturo em uma placa de injeção contendo 10 µl de microgotas de meio global (LifeGlobal, Europa) com 3 ml de óleo mineral equilibrado estéril sobreposição a 37 °C com 6% de CO2 por 10-30 minutos. O volume de acordo com a equação:

x=(volume do pellet x 0,5 x 100)/(motilidade x contagem (após processamento)) 3-Recuperação de oócitos: A recuperação de oócitos foi realizada aproximadamente 36 horas após a administração do gatilho de ovulação. Sob orientação de ultrassom, uma agulha medidora de lúmen único (Reproline, Alemanha) foi usada para aspirar os folículos para coleta rápida de oócitos com uma pressão negativa de 115-120 mm Hg. Ao mesmo tempo, o fluido folicular foi coletado em tubos falcon de 14 ml estéreis de fundo redondo. Sob um microscópio estéreo, os complexos oócito-cúmulos (COCs) foram identificados, lavados e transferidos para meios fertilizantes globais totais (LifeGlobal, Europa) e incubados a 6% de CO2 a 37°C até a desnudação.

4- Desnudação e pontuação dos oócitos: Os COCs foram desnudados colocando-os em uma gota de 100 µ1 de meio tamponado contendo a enzima hialuronidase 80 UI/ml (LifeGlobal, Europa) por 30 a 45 segundos. Em seguida, os oócitos foram suavemente aspirados para dentro e para fora por uma pipeta estéril, resultando na remoção das células coronais (25). Em seguida, um total global com tampão HEPES (LifeGlobal, Europa) foi usado para lavar os oócitos desnudados. Um microscópio invertido equipado com manipuladores automáticos, Narishige, hot stage e óptica Hoffman (Olympus 1x71) foi utilizado para avaliar a maturidade dos ovócitos. A avaliação da maturação oocitária foi a seguinte: oócitos maduros na metáfase II (MII) caracterizados pela extrusão do corpo polar, e oócitos imaturos estavam na fase de vesícula germinativa (GV) caracterizada por uma vesícula germinativa localizada centralmente ou na metáfase I (MI) caracterizado pela ausência tanto do corpo polar quanto da vesícula germinativa. Os ovócitos maduros foram então incubados em meio de cultura em incubadora Labotect com 6% de Co2 a 37 ºC até o momento da injeção intracitoplasmática do espermatozoide. Em contraste, oócitos imaturos irmãos foram incubados em meio de cultura (50 µ) com concentração de 5000 espermatozoides/oócitos e colocados na incubadora Labotect por 10-30 minutos até o momento da seleção dos espermatozóides.

5- ICSI: Oócitos maduros foram colocados em 10 µl de microgotas do total global w/HEPES Buffer (LifeGlobal, Europa) cobertos com 3ml de óleo mineral puro equilibrado para ICSI.

No grupo controle, cada oócito MII foi injetado com um esperma convencionalmente selecionado com base na morfologia e motilidade após ser processado por centrifugação por gradiente de densidade (DGC). No entanto, nos grupos de tratamento, os espermatozóides ligados a ZP foram selecionados da superfície dos oócitos imaturos por meio do uso de uma microagulha (Sunlight Medical, Jacksonville, FL, EUA) e transferidos para uma solução de polivinilpirrolidona (PVP) a 10% (SAGE, EUA), imobilizado e, em seguida, usado para injetar oócitos MII irmãos. O procedimento foi realizado em microscópio invertido equipado com uma pipeta de retenção com leve pressão negativa para manipulação do oócito e uma agulha de injeção para injetar o esperma. Os ovócitos imaturos utilizados para a seleção espermática foram descartados. Em todos os grupos, a agulha de injeção contendo um único espermatozóide foi lenta e constantemente movida através do citoplasma do oócito MII e caiu 1 a 3µl no centro do oócito.

6- Medidas de resultado: Todos os parâmetros embriológicos (i.e. fertilização, clivagem, formação de blastocisto e qualidade do blastocisto) foram registrados e avaliados. Sinais de fertilização foram observados 16-18 horas após a ICSI. Além disso, 48 e 72 h após ICSI, a taxa de clivagem foi avaliada. A taxa de formação de blastocistos foi avaliada no quinto dia pós-ICSI. Os embriões com formação de blastocisto de alta qualidade foram classificados de acordo com o sistema de classificação de blastocisto de Gardner. Este sistema atribui graus de expansão e status de eclosão de acordo com a massa celular interna (ICM) e a qualidade do trofectoderma (TE). Blastocistos de boa qualidade foram classificados como aqueles com 6, 5, 4 ou 3AA, AB ou BA. Blastocistos de qualidade razoável foram aqueles com 6, 5, 4 ou 3 BB.

7-Análise estatística As taxas de fertilização, clivagem, formação de blastocisto e blastocistos de alta qualidade foram relatadas como porcentagens para cada grupo. As características dos pacientes masculinos e femininos (idade, contagem de espermatozóides, motilidade espermática, morfologia espermática, número de oócitos recuperados e número de oócitos maduros e imaturos) foram expressas como média ± desvio padrão (DP). O teste t de Student foi empregado para comparar variáveis ​​contínuas (taxas de fertilização, clivagem, formação de blastocisto e blastocistos de alta qualidade). A análise estatística foi realizada com SPSS 13.0. Valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.