Rektální takrolimus v léčbě rezistentní ulcerózní proktitidy

Zánětlivé střevní onemocnění (IBD) jsou celoživotní onemocnění, často diagnostikované mezi 15. a 35. rokem věku, s narůstající frekvencí. V rozvinutých zemích byla prevalence IBD v roce 2002 asi 100-220/100 000. V poslední době je odhadovaná prevalence CD a UC v USA 201 a 238 na 100 000 obyvatel. To ukazuje na více než 620 000 pacientů s CD a 730 000 pacientů s UC jen v USA. Bylo také zaznamenáno, že výskyt IBD se v posledních dvou desetiletích zvyšuje u etnických menšin v Americe a předpokládá se, že IBD, které bylo dříve považováno za „kavkazské onemocnění“, dosáhne srovnatelné úrovně v Asii. jako v západních zemích do 10-15 let. Jednou z hlavních nákladů na léčbu IBD je nutnost hospitalizace. Ty u pacientů s CD klesají sekundárně v důsledku rostoucího používání biologických terapií, avšak počet hospitalizací pro UC se za posledních 15 let zdvojnásobil. IBD nyní stojí australskou ekonomiku 22 000 000 lidí přes 2,7 miliardy dolarů ročně a to je srovnatelné v celém západním světě.

Takrolimus a cyklosporin jsou klasické inhibitory kalcineurinu a jsou široce používány jako imunosupresivní léky se slibnými výsledky u UC. Kalcineurin nebo proteinová fosfatáza 2B (PP2B) je všudypřítomná cytosolická Ser/Thr proteinová fosfatáza, která je vysoce konzervovaná v eukaryotech. Má schopnost defosforylovat širokou škálu proteinů a může regulovat expresi interleukinu (IL)-2, IL-4 a interferonu (IFN)γ a také modulovat aktivitu transkripčních faktorů, jako je NF-KB. Zvýšená aktivita NF-kB je dobře popsána u CD a UC a indukuje expresi prozánětlivých cytokinů IL-lp, IL-6 a TNFa. Klinické remise lze dosáhnout především snížením hladin těchto cytokinů.

Účinnost perorálního takrolimu byla zkoumána při léčbě CD a UC rezistentních na léky. Bohužel většina těchto studií byla otevřená, pouze jedna randomizovaná kontrolovaná studie hlášená u UC. To prokázalo krátkodobé klinické zlepšení, ale bez významného zvýšení míry remise, potenciálně kvůli nízkému počtu pacientů. Navzdory tomu existuje mnoho otevřených studií jak u UC, tak u CD, které naznačují účinnost v krátkodobém horizontu a se slibnými dlouhodobými údaji. Důkazy by však naznačovaly, že minimální hladina v krvi by měla být alespoň 10 ug/l, aby se dosáhlo nejlepší účinnosti (terapeutické rozmezí 5-20 ug/l), ale čím vyšší je minimální hladina, tím je pravděpodobnější, že pacient bude trpět nepříznivý efekt. Těch může být bohužel mnoho a zahrnují hypertenzi, nevolnost a průjem, hematologické abnormality, poškození ledvin. Problémem je také nárůst výskytu rakoviny kůže, který podporují studie na zvířatech.

Použití topického takrolimu bylo účinné v léčbě periorálního a perineálního zánětu u pediatrických pacientů s CD s vymizením příznaků v 75 %. Práce zkoumající topickou léčbu perianálním takrolimem u dospělých pacientů s CD také prokázala klinickou účinnost, a přestože se takrolimus transdermálně dobře absorbuje, v krvi byly detekovány pouze nízké minimální hladiny takrolimu. V těchto předběžných studiích bylo použití topického takrolimu spojeno s velmi malým počtem nežádoucích účinků. Dlouhodobé místní užívání, stejně jako u perorálních přípravků, může být spojeno se zvýšeným rizikem vzniku rakoviny kůže. Epidemiologické důkazy by však naznačovaly, že riziko je nízké a je lokalizováno na kůži vystavené slunci ošetřené takrolimem.

Nedávná pilotní studie naší skupiny prokázala, že 75 % (6/8) pacientů s rezistentní distální kolitidou reagovalo a dosáhlo remise onemocnění po 4 a 8 týdnech rektální masti obsahující takrolimus8. Dávka 0,3 až 0,5 mg/ml 3 ml dvakrát denně byla identifikována u většiny pacientů k navození remise. U těchto pacientů byly minimální hladiny takrolimu užívány pravidelně a byly buď nedetekovatelné (<1,5 μg/l), subterapeutické (<5 μg/l), nebo při nejvyšších hodnotách v nízkém terapeutickém rozmezí (terapeutické rozmezí 5–20 μg/l ). Mast byla dobře snášena bez jakýchkoli systémových nežádoucích účinků. Použití stejného rektálního přípravku takrolimu u dalších 8 pacientů bylo také spojeno s klinickou odpovědí u 6 pacientů po 4 týdnech léčby.

Účinnost topického takrolimu u UC je dále podpořena samostatnou pilotní studií, která zkoumala topický takrolimus u pacientů s rezistentní distální kolitidou. V této studii došlo ke klinickému a histologickému zlepšení u 10 z 12 pacientů do 4 týdnů bez jakýchkoliv závažných vedlejších účinků a přípravek byl dobře tolerován.

METODOLOGIE

Studijní medikace a dodávka: Příprava rektální masti takrolimus bude provedena v příslušné nemocniční lékárně v každém centru. Při přípravě je třeba nosit rukavice a masku. Koncentrace takrolimu v masti má být 0,5 mg⁄ml. Pět mililitrů propylenglykolu se pomalu vmíchá do požadovaného množství prášku takrolimu na čisté skleněné desce. K tomu se postupně přidá 70 ml parafinového kapalného BP (LP) sériovým ředěním a trituruje, dokud se rovnoměrně nepromíchá. Tento proces bude opakován se 125 ml parafinového bílého měkkého BP (WSP). Výsledný krém bude zabalen do tuby a označen. Přípravek bude formulován na bázi LP ⁄WSP pro snadné rektální použití.

Stabilita léčiv: Krém vyprší po 30 dnech při pokojové teplotě nebo 90 dnech při 4-8 0C

Podávání studovaného léčiva: Celkem 3 ml studovaného léčiva nebo placeba bude pacientem aplikováno rektálně pomocí aplikátoru dvakrát denně po dobu 8 týdnů. Aplikace bude probíhat před spaním a po ranní snídani. Pro pracovníky na směny bude aplikace provedena těsně před spaním a po prvním jídle dne.

Dávkovací schéma:

1. Randomizace: Pacienti budou náhodně rozděleni v poměru 1:1 k podávání takrolimu nebo placeba.
2. Zaslepení: Pacienti ve studii a kliničtí zkoušející budou vůči randomizaci zaslepeni.

Souběžná terapie: Rektální příprava bude ukončena den před zahájením studie. Pacienti budou pokračovat ve stejných perorálních lécích, které užívají na začátku studie.

Screeningová návštěva: Všichni pacienti podepíší informovaný souhlas před jakýmkoli sběrem dat. Demografické údaje pacientů budou zaznamenány. Kultivace a mikroskopie stolice, krevní tlak (BP), úplný krevní obraz (FBC), rychlost sedimentace erytrocytů (ESR), C-reaktivní protein (CRP), močovina, elektrolyty (U&E) a GFR budou lokálně odebrány a změřeny na každém místě . Výsledky těchto testů budou zaslány faxem do centrálního pracoviště v nemocnici Fremantle do 3 dnů od odběru ke kontrole. Fekální kalprotektin bude odebrán a skladován při -20 °C. Tyto vzorky budou zasílány v dávkách na suchém ledu každé 3 měsíce do centrálního pracoviště ve Fremantle Hospital k analýze.

Během 7 dnů před týdnem 0 bude provedena flexibilní sigmoidoskopie. Při endoskopii budou pořízeny dvě sady fotografií, jedna sada distální (do 15 cm od konečníku) a jedna sada proximální (15-25 cm od konečníku). Oblast zobrazující horší úroveň zánětu bude z každé oblasti odebrána 2 biopsie pro histologickou analýzu. Biopsie budou fixovány a blokovány v každé nemocnici. Všechny parafínové bloky budou odeslány do nemocnice Fremantle. Postupujte podle fotografií pro histologickou analýzu. Z každé oblasti budou odebrány čtyři další biopsie pro izolaci RNA. Biopsie z každé oblasti budou okamžitě umístěny do 2 zkumavek označených 'proximální' a 'distální' obsahujících RNAlater a skladovány při -80oC. Ty pak budou poslány v dávkách na suchém ledu každé 3 měsíce do centrálního pracoviště ve Fremantle Hospital k analýze. Vypočte se úplné skóre Mayo, aby se potvrdila přítomnost aktivní UC (skóre Mayo mezi 6 a 12 požadované pro zařazení).

Týden 0: Mayo skóre bude vypočítáno pomocí screeningových endoskopických nálezů a zahájené léčby. Vypočteno základní IBDQ a změřen TK

Týdny 2 a 4: Vypočte se modifikované Mayo skóre, odebere se BP a FBC, ESR, CRP, U&E, jak je popsáno výše, a vyhodnotí se IBDQ. Fekální kalprotektin bude odebrán a skladován při -200 °C. Odebere se krev pro odběr tacrolimu, odebere se sérum a to se skladuje při -20oC. Sérum bude poté odesláno na suchém ledu do centrálního pracoviště ve Fremantle Hospital k posouzení do 2 dnů od odběru. Lékařský monitor (CIA) v nemocnici Fremantle zkontroluje všechny minimální hladiny takrolimu, aby byla zajištěna bezpečnost pacientů.

8. týden nebo vysazení: Flexibilní sigmoidoskopie bude provedena ± 3 dny po návštěvě v týdnu 8 (nebo při předčasném vysazení) a vypočítá se plné Mayo skóre. Fotografie a biopsie budou pořízeny a zpracovány tak, jak je podrobně popsáno při screeningové sigmoidoskopii. Rutinní měření FBC, U&E, ESR, CRP, TK a fekální kalprotektin, jak je popsáno výše

12. týden: Následný telefonát k posouzení případných nežádoucích účinků. Každý histologický vzorek bude posouzen centrálně ve Fremantle Hospital zaslepeným odborným gastroenterologickým histopatologem. Tyto nálezy budou korelovány s endoskopickým skórováním a fotografiemi pořízenými při endoskopii.

Předčasné stažení ze studie: Pacienti mohou ze studie kdykoli odstoupit. Pokud pacient odstoupí z důvodu nedostatečné účinnosti studijního přípravku 4 týdny nebo déle po návštěvě v týdnu 0, bude mít nárok na otevřenou lokální mast takrolimu po dobu 4 týdnů. Před podáním topické masti s takrolimem bude vyžadována flexibilní sigmoidoskopie. Fotografie budou pořízeny před biopsií, jak je popsáno pro procedury v týdnu 0 a 8. Rutinní měření FBC, U&E, ESR, CRP, TK, minimální hladiny takrolimu a fekální kalprotektin se odeberou po 2 týdnech léčby, jak je popsáno výše. Tito pacienti budou způsobilí k analýze pro primární a sekundární koncové body

Průběžná analýza: Po dokončení 8týdenní návštěvy u 20 pacientů bude provedena průběžná analýza provedená nezávislým statistikem a klinickým lékařem, aby se potvrdila bezpečnost léku a vyhodnotila se účinnost. To je nutné před povolením pokračování studie.

Úrovně exprese mRNA: Biopsie (4x) odebrané ze dvou oblastí pro distální tračník (do 15 cm od řitního otvoru a 15-25 cm od řitního otvoru). Oblast obsahující horší zánět pozorovaný při endoskopickém vyšetření v týdnech 0 a 8 (nebo při předčasném vysazení) bude zaznamenána. Všechny vzorky budou později okamžitě umístěny do RNA a uloženy při -80 °C před přenesením na suchém ledu do centrálního místa v nemocnici Fremantle. U každé skupiny vzorků budou stanoveny hladiny exprese mRNA TNFa, IFN-y, IL-lp, IL-2, IL4, IL-10 a IL-6. Celková RNA bude izolována a ošetřena DNázou pomocí soupravy Qiagen 96 RNeasy® (Qiagen, Clifton Hill, Austrálie) podle pokynů výrobce. Kvalita vzorků RNA bude ověřena, provedena reverzní transkripce a cDNA kvantifikována pomocí PCR v reálném čase pomocí QuantiTect SYBR Green Master Mix (Qiagen) na ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Budou použity specifické primery pro mRNA. Analýza disociační křivky potvrdí specifičnost amplifikace a počet kopií se určí ze standardních křivek plazmidu nebo produktu PCR. Počet kopií cílové mRNA bude normalizován proti počtu kopií referenčního genu pro každý vzorek cDNA. Výše uvedené metody jsou již dostupné v laboratoři CIA v nemocnici Fremantle. Limit detekce mRNA je 3 pg/ml pro všechny cytokiny

Statistická analýza: Provede se srovnání mezi expresí mRNA v endoskopických biopsiích odebraných v týdnech 0 a 8 (nebo při vysazení) v rameni léčby takrolimem a porovná se mezi sebou navzájem a s těmi z kontrolního ramene s placebem ve stejných časových bodech. Hladiny exprese mRNA budou korelovat s endoskopickým a histologickým skóre zánětu. Rozdíly mezi skupinami budou hodnoceny pomocí jednocestné ANOVA na log-transformovaných datech. Statistická analýza bude provedena s použitím Statistického balíčku pro společenské vědy (SPSS) verze 17. Statistická významnost se považuje za p<0,05 pro všechny analýzy.