難治性潰瘍性直腸炎の治療における直腸タクロリムス

炎症性腸疾患 (IBD) は、15 歳から 35 歳の間に診断されることが多い生涯にわたる状態であり、その頻度は増加しています。 先進国では、2002 年の IBD 有病率は 100,000 人あたり約 100 ～ 220 人でした。 最近では、米国における CD および UC の推定有病率は、それぞれ 100,000 人あたり 201 人および 238 人です。 これは、米国だけで 620,000 人を超える CD 患者と 730,000 人を超える UC 患者を示しています。 過去 20 年間、アメリカの少数民族で IBD の発生率が増加していることも注目されており、以前は「白人の病気」と考えられていた IBD は、アジアでも同等のレベルに達すると予測されています。西側諸国と同様に、10〜15年以内に。 IBD 治療の主な費用の 1 つは、入院の必要性です。 これらは、生物学的療法の使用の増加に続いて CD 患者で減少していますが、UC の入院は過去 15 年間で 2 倍になっています。 IBD は現在、22,000,000 人のオーストラリア経済に年間 27 億ドル以上の費用をかけており、これは西側世界全体で匹敵します。

タクロリムスとシクロス​​ポリンは古典的なカルシニューリン阻害剤であり、免疫抑制薬として広く使用されており、UC で有望な結果が得られています。 カルシニューリン、またはプロテインホスファターゼ 2B (PP2B) は、真核生物で高度に保存されている遍在的に発現するサイトゾル Ser/Thr プロテインホスファターゼです。 幅広いタンパク質を脱リン酸化する能力があり、インターロイキン (IL)-2、IL-4、およびインターフェロン (IFN)γ の発現を調節するだけでなく、NF-κB などの転写因子の活性を調節することができます。 強化された NF-kB 活性は、CD および UC でよく説明されており、炎症性サイトカイン IL-1β、IL-6、および TNFα の発現を誘導します。 臨床的寛解が達成される可能性があるのは、主にこれらのサイトカインのレベルの低下によるものです。

経口タクロリムスの有効性は、薬剤耐性 CD および UC の管理において検討されています。 残念ながら、これらの研究の大部分はオープンラベルであり、UCで報告されたランダム化比較試験は1つだけです. これは短期的な臨床的改善を示しましたが、患者数が少ない可能性があるため、寛解率の大幅な増加はありませんでした. それにもかかわらず、UC と CD の両方で、短期的な有効性と有望な長期データを示唆する多くの非盲検研究があります。 しかしながら、最良の有効性（治療範囲5～20ug/L）を達成するためには、血中トラフレベルが少なくとも10ug/Lでなければならないことを証拠は示唆しているが、トラフレベルが高いほど、患者が苦しむ可能性が高くなる.悪影響。 残念なことに、これらは非常に多く、高血圧、吐き気や下痢、血液学的異常、腎機能障害などがあります。 皮膚がんの発生率の増加も懸念事項であり、動物実験によって裏付けられた懸念事項です。

局所タクロリムスの使用は、小児 CD 患者の口周囲および会陰の炎症の治療に有効であり、75% で症状が解消されています。 成人 CD 患者の肛門周囲の局所タクロリムス療法を調査した研究でも、臨床的有効性が実証されました。 これらの予備研究では、局所タクロリムスの使用はほとんど副作用と関連していませんでした. 経口製剤と同様に、長期の局所使用は、皮膚がん形成のリスクの増加と関連している可能性があります。 しかし、疫学的証拠は、リスクが低く、タクロリムスで治療された日光にさらされた皮膚に局在していることを示唆しています.

私たちのグループによる最近のパイロット研究では、抵抗性遠位大腸炎患者の 75% (6/8) が反応し、タクロリムス直腸軟膏を 4 週間および 8 週間使用した後、疾患の寛解を達成したことが示されました8。 1日2回、0.3～0.5mg/ml 3mlの用量で、ほとんどの患者で寛解を誘導することが確認されました。 これらの患者では、タクロリムスのトラフ値が定期的に測定され、検出不能 (< 1.5 μg/L) 治療レベル以下 (< 5 μg/L) であるか、または最高でも低治療範囲 (治療範囲 5 ～ 20 μg/L) でした。 ）。 軟膏は忍容性が高く、全身的な悪影響はありませんでした。 さらに 8 人の患者に同じ直腸タクロリムス製剤を使用したところ、4 週間の治療後に 6 人の患者に臨床反応が見られました。

UC における局所タクロリムスの有効性は、抵抗性遠位大腸炎患者における局所タクロリムスを調べた別のパイロット研究によってさらに裏付けられています。 この研究では、4 週間までに 12 人の患者のうち 10 人の患者で臨床的および組織学的な改善が報告され、主要な副作用は報告されておらず、製剤は忍容性が良好でした。

方法論

治験薬および供給：タクロリムス直腸軟膏の調製は、各センターのそれぞれの病院の薬局で行われます。 準備の際は手袋とマスクを着用する。 軟膏中のタクロリムスの濃度は、0.5 mg/mL とする。 5ミリリットルのプロピレングリコールを、きれいなガラススラブ上で必要な量のタクロリムス粉末にゆっくりと混ぜます. これに、70 mL のパラフィン液体 BP (LP) を段階希釈によって徐々に追加し、均等に混合されるまで粉砕します。 このプロセスは、125 mL のパラフィン ホワイト ソフト BP (WSP) で繰り返されます。 得られたクリームはチューブに詰められ、ラベルが付けられます。 製剤は、直腸での使用を容易にするために LP ⁄WSP ベースを使用して処方されます。

薬の安定性: クリームは室温で 30 日、または 4 ～ 8 ℃ で 90 日後に失効します。

治験薬の投与：合計3mlの治験薬またはプラセボを、8週間にわたって患者が1日2回、アプリケーターを介して直腸に適用します。 申請は就寝前と朝の朝食後に行われます。 シフト労働者の場合、就寝直前とその日の最初の食事の後に適用されます。

投与スケジュール:

1. 無作為化: 患者は、タクロリムスまたはプラセボを受け取るために 1:1 の比率で無作為に割り当てられます。
2. 盲検化: 治験患者と治験責任医師は無作為化に対して盲検化されます。

併用療法:直腸の準備は、試験開始の前日に中止されます。 患者は、研究開始時と同じ経口薬を継続します。

スクリーニング訪問：すべての患者は、データ収集の前にインフォームドコンセントに署名します。 患者の人口統計が記録される。 便培養および顕微鏡検査、血圧 (BP)、全血球計算 (FBC)、赤血球沈降速度 (ESR)、C 反応性タンパク質 (CRP)、尿素、電解質 (U&E)、および GFR が採取され、各部位で局所的に測定されます。 . これらのテストの結果は、収集後 3 日以内にレビューのためにフリーマントル病院の中央サイトにファックスで送信されます。 糞便カルプロテクチンを採取し、-20℃で保存します。 これらの標本は、分析のためにフリーマントル病院の中央サイトに 3 か月ごとにドライアイスでまとめて送られます。

週0の7日前までに柔軟なS状結腸鏡検査が行われます。 内視鏡検査で 2 セットの写真を撮影します。 炎症のより悪いレベルを示す領域は、組織学的分析のために各領域から2つの生検が採取される。 生検は、各病院のサイトで修正およびブロックされます。 パラフィンブロックはすべてフリーマントル病院に送られます。 組織学的分析のために写真をたどります。 RNA分離のために、各領域から4つの追加の生検が採取されます。 各領域からの生検は、RNAlater を含む「近位」および「遠位」とラベル付けされた 2 つのチューブにすぐに配置され、-80℃で保存されます。 これらは、分析のために 3 か月ごとにドライアイスにまとめてフリーマントル病院の中央サイトに送られます。 完全な Mayo スコアは、アクティブな UC の存在を確認するために計算されます (含めるには 6 ～ 12 の Mayo スコアが必要です)。

0 週目: Mayo スコアは、スクリーニング内視鏡所見と開始された治療を使用して計算されます。 ベースライン IBDQ の計算と BP の測定

2 週目と 4 週目: 修正 Mayo スコアを計算し、BP を測定し、上記のように FBC、ESR、CRP、U&E を測定し、IBDQ を評価します。 糞便カルプロテクチンを採取し、-20℃で保存します。 タクロリムス トラフ用の血液を採取し、血清を採取し、-20℃で保存します。 その後、血清はドライアイスでフリーマントル病院の中央サイトに送られ、収集後 2 日以内に評価されます。 フリーマントル病院の医療モニター (CIA) は、患者の安全を確保するためにすべてのタクロリムス トラフ レベルを確認します。

8週目または離脱:柔軟なS状結腸鏡検査が行われます ±週8回の訪問の3日（または早期離脱時）および完全なMayoスコアが計算されます。 S状結腸内視鏡検査のスクリーニングで詳述されているように、写真と生検が撮影され、処理されます。 ルーチンの FBC、U&E、ESR、CRP、BP 測定、および上記の糞便カルプロテクチン

12 週目: 有害事象を評価するためのフォローアップの電話。 各組織標本は、フリーマントル病院で、盲目の専門の消化器組織病理学者によって中央で評価されます。 これらの調査結果は、内視鏡検査で撮影された内視鏡スコアおよび写真と関連付けられます。

試験からの早期離脱：患者はいつでも試験から自由に離脱できます。 患者が有効性の欠如のために中止する場合 研究準備の有効性がないため 0週目の訪問から4週間以上経過した場合、非盲検使用の局所タクロリムス軟膏を4週間使用できます。 局所タクロリムス軟膏を供給する前に、柔軟なS状結腸内視鏡検査を撤回する必要があります。 0 週目と 8 週目の手順で説明したように、生検の前に写真を撮ります。 ルーチンのＦＢＣ、Ｕ＆Ｅ、ＥＳＲ、ＣＲＰ、測定されたＢＰ、タクロリムストラフレベル、および糞便カルプロテクチンは、上記のように２週間の治療後に摂取される。 これらの患者は、一次および二次エンドポイントの分析の対象となります

中間分析：20人の患者が8週間の訪問を完了した後、独立した統計学者および臨床医による中間分析が行われ、薬物の安全性が確認され、有効性が評価されます。 これは、研究の継続を許可する前に必要となります。

mRNA 発現レベル: 遠位結腸の 2 つの領域 (肛門から 15cm 以内および肛門から 15 ～ 25cm 以内) から採取した生検 (x4)。 0 週目と 8 週目 (または早期離脱時) の内視鏡検査で見られるより悪い炎症を含む領域が記録されます。 すべてのサンプルは、後ですぐに RNA に入れ、-80℃ で保存した後、フリーマントル病院の中央サイトにドライアイスで移します。 ＴＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ４、ＩＬ－１０およびＩＬ－６ ｍＲＮＡ発現のレベルは、サンプルの各群について決定される。 全ＲＮＡを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ９６ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、クリフトンヒル、オーストラリア）を製造元の指示に従って使用してＤＮａｓｅ処理する。 RNAサンプルの品質を検証し、逆転写を行い、ABI PRISM 7900HT（Applied Biosystems）でQuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）を使用してリアルタイムPCRでcDNAを定量します。 mRNAに特異的なプライマーが使用されます。 解離曲線分析により増幅の特異性が確認され、コピー数はプラスミドまたは PCR 産物の標準曲線から決定されます。 ターゲット mRNA のコピー数は、各 cDNA サンプルの参照遺伝子のコピー数に対して正規化されます。 上記の方法は、フリーマントル病院の CIA の研究室ですでに利用可能です。 mRNAの検出限界はすべてのサイトカインで3pg/ml

統計分析：タクロリムス治療群で0週目と8週目（または離脱時）に採取された内視鏡生検のmRNA発現の比較が行われ、互いに比較され、同じ時点でプラセボ対照群からのものと比較されます。 mRNA発現レベルは、内視鏡および組織学的炎症スコアと相関します。 グループ間の違いは、対数変換されたデータに対して一元配置分散分析を使用して評価されます。 統計分析は、社会科学用統計パッケージ（SPSS）バージョン17を使用して実施されます。統計的有意性は、すべての分析でp <0.05と見なされます。