Rektales Tacrolimus bei der Behandlung von resistenter ulzerativer Proktitis

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind lebenslange Erkrankungen, die häufig im Alter zwischen 15 und 35 Jahren diagnostiziert werden und an Häufigkeit zunehmen. In Industrieländern lag die IBD-Prävalenz im Jahr 2002 bei etwa 100-220/100.000. In jüngerer Zeit beträgt die geschätzte Prävalenz von CD und UC in den USA 201 bzw. 238 pro 100.000. Dies weist auf mehr als 620.000 MC- und 730.000 CU-Patienten allein in den USA hin. Es wurde auch festgestellt, dass die Inzidenz von CED in den ethnischen Minderheiten in Amerika in den letzten zwei Jahrzehnten zugenommen hat, und es wird vorhergesagt, dass CED, das früher als „kaukasische Krankheit“ galt, in Asien ein vergleichbares Ausmaß erreichen wird wie in den westlichen Ländern innerhalb von 10-15 Jahren. Einer der Hauptkosten bei der IBD-Behandlung ist die Notwendigkeit einer Krankenhauseinweisung. Diese sind für CD-Patienten aufgrund des zunehmenden Einsatzes biologischer Therapien zurückgegangen, jedoch haben sich die Zulassungen für CU in den letzten 15 Jahren verdoppelt. IBD kostet die australische Wirtschaft mit 22.000.000 Menschen jährlich über 2,7 Milliarden Dollar, und dies ist in der gesamten westlichen Welt vergleichbar.

Tacrolimus und Cyclosporin sind klassische Calcineurin-Inhibitoren und werden häufig als immunsuppressive Medikamente mit vielversprechenden Ergebnissen bei CU eingesetzt. Calcineurin oder Proteinphosphatase 2B (PP2B) ist eine ubiquitär exprimierte zytosolische Ser/Thr-Proteinphosphatase, die in Eukaryoten hoch konserviert ist. Es hat die Fähigkeit, ein breites Spektrum an Proteinen zu dephosphorylieren und kann die Expression von Interleukin (IL)-2, IL-4 und Interferon (IFN)γ regulieren sowie die Aktivität von Transkriptionsfaktoren wie NF-κB modulieren. Eine erhöhte NF-kB-Aktivität ist bei MC und UC gut beschrieben und induziert die Expression der proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6 und TNFα. In erster Linie durch die Verringerung der Spiegel dieser Zytokine kann eine klinische Remission erreicht werden.

Die Wirksamkeit von oralem Tacrolimus wurde bei der Behandlung von medikamentenresistenter CD und UC untersucht. Leider waren die meisten dieser Studien offen, wobei nur eine randomisierte kontrollierte Studie über Colitis ulcerosa berichtet wurde. Dies zeigte eine kurzfristige klinische Verbesserung, jedoch ohne signifikante Erhöhung der Remissionsrate, möglicherweise aufgrund niedriger Patientenzahlen. Trotzdem gibt es zahlreiche Open-Label-Studien sowohl bei CU als auch bei CD, die eine kurzfristige Wirksamkeit und vielversprechende Langzeitdaten nahelegen. Die Beweise deuten jedoch darauf hin, dass der Talspiegel im Blut mindestens 10 ug/l betragen sollte, um die beste Wirksamkeit zu erzielen (therapeutischer Bereich 5-20 ug/l), aber je höher der Talspiegel, desto wahrscheinlicher wird ein Patient leiden nachteilige Auswirkungen. Diese können leider zahlreich sein und umfassen Bluthochdruck, Übelkeit und Durchfall, hämatologische Anomalien, Nierenfunktionsstörung. Die Zunahme der Hautkrebsrate ist ebenfalls ein Problem, ein Problem, das durch Tierversuche gestützt wird.

Die Anwendung von topischem Tacrolimus war bei der Behandlung von perioralen und perinealen Entzündungen bei pädiatrischen MC-Patienten wirksam, wobei die Symptome bei 75 % zurückgingen. Untersuchungen zur topischen perianalen Tacrolimus-Therapie bei erwachsenen MC-Patienten zeigten ebenfalls eine klinische Wirksamkeit, und obwohl Tacrolimus transdermal gut resorbiert wird, wurden im Blut nur niedrige Tacrolimus-Talspiegel nachgewiesen. In diesen vorläufigen Studien war die Anwendung von topischem Tacrolimus mit sehr wenigen Nebenwirkungen verbunden. Die langfristige topische Anwendung kann wie bei oralen Formulierungen mit einem erhöhten Risiko der Hautkrebsbildung verbunden sein. Epidemiologische Beweise deuten jedoch darauf hin, dass das Risiko gering und auf die mit Tacrolimus behandelte, der Sonne ausgesetzte Haut beschränkt ist.

Die jüngste Pilotstudie unserer Gruppe hat gezeigt, dass 75 % (6/8) der Patienten mit resistenter distaler Kolitis nach 4 und 8 Wochen Behandlung mit Tacrolimus-Rektalsalbe ansprachen und eine Remission ihrer Krankheit erreichten8. Eine Dosis von 0,3 bis 0,5 mg/ml 3 ml zweimal täglich wurde bei der Mehrzahl der Patienten zur Induktion einer Remission identifiziert. Bei diesen Patienten wurden die Tacrolimus-Talspiegel regelmäßig eingenommen und waren entweder nicht nachweisbar (< 1,5 μg/l), subtherapeutisch (< 5 μg/l) oder am höchsten im niedrigen therapeutischen Bereich (therapeutischer Bereich 5–20 μg/l). ). Die Salbe wurde ohne systemische Nebenwirkungen gut vertragen. Die Anwendung der gleichen rektalen Tacrolimus-Zubereitung bei weiteren 8 Patienten war ebenfalls mit einem klinischen Ansprechen bei 6 Patienten nach 4-wöchiger Therapie verbunden.

Die Wirksamkeit von topischem Tacrolimus bei Colitis ulcerosa wird ferner durch eine separate Pilotstudie gestützt, in der topisches Tacrolimus bei Patienten mit resistenter distaler Kolitis untersucht wurde. In dieser Studie wurde eine klinische und histologische Besserung bei 10 von 12 Patienten nach 4 Wochen ohne größere Nebenwirkungen berichtet und das Präparat wurde gut vertragen.

METHODIK

Studienmedikation und -versorgung: Die Zubereitung der Tacrolimus-Rektalsalbe erfolgt in der jeweiligen Krankenhausapotheke des jeweiligen Zentrums. Bei der Zubereitung sind Handschuhe und Maske zu tragen. Die Konzentration von Tacrolimus in der Salbe muss 0,5 mg/ml betragen. Fünf Milliliter Propylenglykol werden auf einer sauberen Glasplatte langsam in die gewünschte Menge Tacrolimus-Pulver eingemischt. Dazu werden 70 ml Paraffinflüssigkeit BP (LP) nach und nach durch Reihenverdünnung hinzugefügt und verrieben, bis sie gleichmäßig vermischt sind. Dieser Vorgang wird mit 125 ml paraffinweißem weichem BP (WSP) wiederholt. Die resultierende Creme wird in Tuben verpackt und etikettiert. Das Präparat wird unter Verwendung der LP ⁄WSP-Basis formuliert, um die rektale Anwendung zu erleichtern.

Haltbarkeit der Medikamente: Die Creme ist nach 30 Tagen bei Raumtemperatur oder 90 Tagen bei 4-8 0 C haltbar

Verabreichung der Studienmedikation: Insgesamt 3 ml der Studienmedikation oder des Placebos werden vom Patienten über einen Zeitraum von 8 Wochen zweimal täglich rektal über einen Applikator aufgetragen. Die Anwendung erfolgt morgens vor dem Zubettgehen und nach dem Frühstück. Für Schichtarbeiter erfolgt die Anwendung unmittelbar vor dem Schlafengehen und nach der ersten Mahlzeit des Tages.

Dosierungsschema:

1. Randomisierung: Die Patienten werden nach dem Zufallsprinzip im Verhältnis 1:1 entweder Tacrolimus oder Placebo zugeteilt.
2. Verblindung: Die Studienpatienten und die klinischen Prüfärzte werden gegenüber der Randomisierung verblindet.

Begleittherapie: Die rektale Präparation wird einen Tag vor Studienbeginn eingestellt. Die Patienten werden weiterhin mit den gleichen oralen Medikamenten behandelt, die sie zu Beginn der Studie einnehmen.

Screening-Besuch: Alle Patienten werden vor jeder Datenerhebung ihre Einverständniserklärung unterschreiben. Patientendaten werden aufgezeichnet. Stuhlkultur und Mikroskopie, Blutdruck (BP), großes Blutbild (FBC), Erythrozytensedimentationsrate (ESR), C-reaktives Protein (CRP), Harnstoff, Elektrolyte (U&E) und GFR werden entnommen und lokal an jedem Standort gemessen . Die Ergebnisse dieser Tests werden innerhalb von 3 Tagen nach Abholung zur Überprüfung an die zentrale Stelle des Fremantle-Krankenhauses gefaxt. Fäkales Calprotectin wird entnommen und bei -200 °C gelagert. Diese Proben werden alle 3 Monate in Chargen auf Trockeneis zur Analyse an den zentralen Standort des Fremantle Hospital geschickt.

Innerhalb von 7 Tagen vor Woche 0 wird eine flexible Sigmoidoskopie durchgeführt. Bei der Endoskopie werden zwei Sätze von Fotos gemacht, ein Satz distal (innerhalb von 15 cm vom Anus) und ein Satz proximal (15-25 cm vom Anus entfernt). Aus der Region mit dem schlimmsten Entzündungsgrad werden 2 Biopsien aus jeder Region zur histologischen Analyse entnommen. Biopsien werden an jedem Krankenhausstandort fixiert und gesperrt. Alle Paraffinblöcke werden notiert an das Fremantle Hospital geschickt. Nachfolgend die Fotos zur histologischen Analyse. Aus jeder Region werden vier zusätzliche Biopsien zur RNA-Isolierung entnommen. Die Biopsien aus jeder Region werden sofort in 2 mit „proximal“ und „distal“ gekennzeichnete Röhrchen mit RNAlater gegeben und bei -80 °C gelagert. Diese werden dann alle 3 Monate in Chargen auf Trockeneis zur Analyse an den zentralen Standort des Fremantle Hospital geschickt. Ein vollständiger Mayo-Score wird berechnet, um das Vorhandensein einer aktiven CU zu bestätigen (ein Mayo-Score zwischen 6 und 12 ist für die Aufnahme erforderlich).

Woche 0: Ein Mayo-Score wird anhand der endoskopischen Screening-Befunde berechnet und die Behandlung eingeleitet. Baseline IBDQ berechnet und BP gemessen

Wochen 2 und 4: Ein modifizierter Mayo-Score wird berechnet, BP gemessen und FBC, ESR, CRP, U&E wie oben beschrieben und der IBDQ bewertet. Das fäkale Calprotectin wird entnommen und bei -200°C gelagert. Blut für die Tacrolimuswanne wird abgenommen, das Serum gesammelt und bei -20oC gelagert. Das Serum wird dann innerhalb von 2 Tagen nach der Entnahme auf Trockeneis an die zentrale Stelle im Fremantle Hospital zur Beurteilung geschickt. Der medizinische Monitor (CIA) des Fremantle Hospital wird alle Tacrolimus-Talspiegel überprüfen, um die Patientensicherheit zu gewährleisten.

Woche 8 oder Entzug: An ± 3 Tagen des Besuchs in Woche 8 (oder bei vorzeitigem Entzug) wird eine flexible Sigmoidoskopie durchgeführt und ein vollständiger Mayo-Score berechnet. Fotos und Biopsien werden wie bei der Screening-Sigmoidoskopie beschrieben angefertigt und verarbeitet. Routinemäßig FBC, U&E, BSG, CRP, BP gemessen und fäkales Calprotectin wie oben beschrieben

Woche 12: Follow-up-Telefonanruf zur Beurteilung von unerwünschten Ereignissen. Jede histologische Probe wird zentral im Fremantle Hospital von einem verblindeten spezialisierten gastroenterologischen Histopathologen beurteilt. Diese Befunde werden mit der endoskopischen Wertung und den bei der Endoskopie aufgenommenen Fotos korreliert.

Vorzeitiges Ausscheiden aus der Studie: Patienten können jederzeit aus der Studie ausscheiden. Wenn der Patient 4 Wochen oder länger nach dem Besuch in Woche 0 aufgrund mangelnder Wirksamkeit des Studienpräparats aus der Studie ausscheidet, hat er Anspruch auf eine unverblindete topische Tacrolimus-Salbe für 4 Wochen. Vor der Verabreichung der topischen Tacrolimus-Salbe ist eine flexible Entzugs-Sigmoidoskopie erforderlich. Fotos werden vor den Biopsien gemacht, wie für die Verfahren in Woche 0 und 8 beschrieben. Routinemäßige FBC, U&E, ESR, CRP, gemessener Blutdruck, Tacrolimus-Talspiegel und fäkales Calprotectin werden nach 2-wöchiger Therapie wie oben beschrieben eingenommen. Diese Patienten sind für die Analyse der primären und sekundären Endpunkte geeignet

Zwischenanalyse: Nachdem 20 Patienten den 8-wöchigen Besuch abgeschlossen haben, wird eine Zwischenanalyse durch einen unabhängigen Statistiker und Kliniker durchgeführt, um die Arzneimittelsicherheit zu bestätigen und die Wirksamkeit zu bewerten. Dies ist erforderlich, bevor die Studie fortgesetzt werden kann.

mRNA-Expressionsniveaus: Biopsien (x4) aus zwei Regionen für den distalen Dickdarm (innerhalb von 15 cm vom Anus und 15–25 cm vom Anus entfernt). Die Region mit der schlimmsten Entzündung, die bei der endoskopischen Untersuchung in den Wochen 0 und 8 (oder beim frühen Absetzen) zu sehen war, wurde notiert. Alle Proben werden später sofort in RNA eingebracht und bei -800 °C gelagert, bevor sie auf Trockeneis zum zentralen Standort im Fremantle Hospital transferiert werden. Die Niveaus der TNFα-, IFN-γ-, IL-1β-, IL-2-, IL4-, IL-10- und IL-6-mRNA-Expression werden für jede Probengruppe bestimmt. Gesamt-RNA wird isoliert und DNase-behandelt unter Verwendung des Qiagen 96 RNeasy®-Kits (Qiagen, Clifton Hill, Australien) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Qualität der RNA-Proben wird verifiziert, eine reverse Transkription durchgeführt und die cDNA durch Echtzeit-PCR mit QuantiTect SYBR Green Master Mix (Qiagen) auf dem ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems) quantifiziert. Es werden spezifische Primer für die mRNAs verwendet. Die Dissoziationskurvenanalyse bestätigt die Spezifität der Amplifikation, und die Kopienzahlen werden aus Plasmid- oder PCR-Produkt-Standardkurven bestimmt. Die Kopienzahlen der Ziel-mRNA werden für jede cDNA-Probe gegen die Kopienzahl des Referenzgens normalisiert. Die oben genannten Methoden sind bereits im Labor der CIA im Fremantle Hospital verfügbar. Die Grenze des mRNA-Nachweises liegt für alle Zytokine bei 3 pg/ml

Statistische Analyse: Vergleiche zwischen der mRNA-Expression in endoskopischen Biopsien, die in Woche 0 und 8 (oder beim Absetzen) im Tacrolimus-Behandlungsarm entnommen wurden, werden durchgeführt und miteinander und mit denen aus dem Placebo-Kontrollarm zu denselben Zeitpunkten verglichen. Die mRNA-Expressionsniveaus werden mit den endoskopischen und histologischen Entzündungsscores korreliert. Unterschiede zwischen den Gruppen werden unter Verwendung von Einweg-ANOVA an logarithmisch transformierten Daten bewertet. Die statistische Analyse wird unter Verwendung des Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Version 17 durchgeführt. Die statistische Signifikanz wird für alle Analysen mit p < 0,05 angenommen.