저항성 궤양성 직장염 치료에서 직장 타크로리무스

염증성 장 질환(IBD)은 빈도가 증가하고 있는 15세에서 35세 사이에 종종 진단되는 평생 질환입니다. 선진국에서 IBD 유병률은 2002년에 약 100-220/100,000이었습니다. 보다 최근에 미국에서 CD 및 UC의 추정 유병률은 각각 100,000명당 201명 및 238명입니다. 이것은 미국에서만 620,000명 이상의 CD 및 730,000명 이상의 UC 환자를 나타냅니다. 또한 지난 20년 동안 미국의 소수민족에서 IBD 발병률이 증가하고 있으며, 이전에는 '백인병'으로 여겨졌던 IBD가 아시아에서 비슷한 수준에 도달할 것으로 예측됩니다. 10-15년 이내에 서양 국가에서와 같이. IBD 치료의 주요 비용 중 하나는 병원 입원의 필요성입니다. 생물학적 요법의 사용 증가로 인해 CD 환자의 수가 감소했지만 UC에 대한 입원은 지난 15년 동안 두 배로 증가했습니다. 현재 IBD는 연간 27억 달러가 넘는 22,000,000명의 호주 경제에 비용을 들이고 있으며 이는 서구 세계 전역에서 비교할 수 있습니다.

타크로리무스와 사이클로스포린은 고전적인 칼시뉴린 억제제이며 UC에서 유망한 결과를 보이는 면역억제제로 널리 사용됩니다. 칼시뉴린 또는 단백질 포스파타제 2B(PP2B)는 편재적으로 발현되는 세포질 Ser/Thr 단백질 포스파타제이며 진핵생물에서 고도로 보존됩니다. 그것은 광범위한 단백질을 탈인산화하는 능력이 있으며 인터루킨(IL)-2, IL-4 및 인터페론(IFN)γ 발현을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 NF-κB와 같은 전사 인자의 활성을 조절할 수 있습니다. 향상된 NF-kB 활성은 CD 및 UC에서 잘 설명되며 전 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNFα 발현을 유도합니다. 임상적 완화가 달성될 수 있는 것은 주로 이러한 사이토카인 수준의 감소를 통해서입니다.

약물 내성 CD 및 UC의 관리에서 경구 타크로리무스의 효능이 조사되었습니다. 불행하게도, 이러한 연구의 대부분은 UC에서 보고된 단 하나의 무작위 통제 시험으로 공개 라벨이 지정되었습니다. 이것은 단기적인 임상적 개선을 보여주었지만 잠재적으로 낮은 환자 수로 인해 관해율이 크게 증가하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 UC와 CD 모두에서 단기 및 유망한 장기 데이터로 효능을 제안하는 수많은 공개 라벨 연구가 있습니다. 그러나 증거에 따르면 최상의 효능(치료 범위 5-20ug/L)을 달성하려면 혈중 최저 수준이 최소 10ug/L여야 하지만 최저 수준이 높을수록 환자가 고통을 겪을 가능성이 높아집니다. 역효과. 불행하게도 고혈압, 메스꺼움 및 설사, 혈액학적 이상, 신장 손상 등 수많은 증상이 나타날 수 있습니다. 피부암 발병률의 증가 또한 동물 연구에서 뒷받침되는 우려 사항입니다.

국소 타크로리무스의 사용은 소아 크론병 환자의 구강 및 회음부 염증 치료에 효과가 있었으며 증상이 75% 해결되었습니다. 성인 CD 환자의 국소 항문주위 타크로리무스 요법을 조사한 연구에서도 임상적 효능이 입증되었으며, 타크로리무스는 경피적으로 잘 흡수되지만 혈중 낮은 수준의 타크로리무스만 검출되었습니다. 이러한 예비 연구에서 국소 타크롤리무스의 사용은 부작용이 거의 없었습니다. 경구 제형과 마찬가지로 장기간 국소 사용하면 피부암 형성 위험이 증가할 수 있습니다. 그러나 역학적 증거는 위험이 낮고 타크로리무스로 처리된 햇빛에 노출된 피부에 국한되어 있음을 시사합니다.

우리 그룹의 최근 파일럿 연구에서는 저항성 원위 대장염 환자의 75%(6/8)가 타크로리무스 직장 연고 4주 및 8주 후에 반응을 보였고 질병이 완화되었음을 보여주었습니다8. 0.3~0.5mg/ml 3ml 1일 2회 용량이 대부분의 환자에서 관해를 유도하는 것으로 확인되었다. 이 환자들에서 tacrolimus 최저 수치는 정기적으로 측정되었고 검출되지 않았으며(<1.5μg/L) 준치료적(<5μg/L)이거나, 최고에서 낮은 치료 범위(치료 범위 5-20μg/L)였습니다. ). 연고는 어떠한 전신 부작용 없이 내약성이 좋았다. 추가 8명의 환자에서 동일한 직장 타크로리무스 제제를 사용한 것은 또한 4주 치료 후 6명의 환자에서 임상 반응과 관련이 있었습니다.

UC에서 국소 타크로리무스의 효능은 저항성 원위 대장염 환자에서 국소 타크로리무스를 조사한 별도의 파일럿 연구에 의해 추가로 뒷받침됩니다. 이 연구에서 보고된 주요 부작용 없이 4주까지 12명의 환자 중 10명에서 임상적 및 조직학적 개선이 보고되었으며 제제는 내약성이 양호했습니다.

방법론

연구 약물 및 공급: 타크로리무스 직장 연고의 준비는 각 센터의 해당 병원 약국에서 수행됩니다. 준비를 할 때 장갑과 마스크를 착용해야 합니다. 연고의 타크로리무스 농도는 0.5 mg/mL이어야 합니다. 5밀리리터의 프로필렌 글리콜을 깨끗한 유리 슬래브에서 원하는 양의 타크로리무스 분말과 천천히 혼합합니다. 여기에 70mL의 파라핀 액체 BP(LP)를 연속 희석하여 점차적으로 첨가하고 균일하게 혼합될 때까지 분쇄합니다. 이 과정은 125mL의 paraffin white soft BP(WSP)로 반복됩니다. 생성된 크림은 튜브에 포장되고 라벨이 부착됩니다. 제제는 직장 사용의 용이성을 위해 LP ⁄WSP 베이스를 사용하여 공식화됩니다.

약물 안정성: 크림은 실온에서 30일 또는 4-8 0C에서 90일 후에 만료됩니다.

연구 약물의 투여: 총 3ml의 연구 약물 또는 위약을 어플리케이터를 통해 8주 동안 환자가 하루에 두 번 직장에 적용합니다. 신청은 잠자리에 들기 전과 아침 식사 후에 이루어집니다. 교대 근무자의 경우 잠자리에 들기 직전과 하루의 첫 번째 식사 후에 적용됩니다.

복용량 일정:

1. 무작위 배정: 환자는 타크로리무스 또는 위약을 투여받기 위해 1:1 비율로 무작위 배정됩니다.
2. 눈가림: 시험 환자와 임상 조사자는 무작위화에 대해 눈이 멀게 됩니다.

병용 요법: 시험을 시작하기 하루 전에 직장 준비를 중단합니다. 환자는 연구 시작 시 복용하고 있는 것과 동일한 경구 약물을 계속 복용하게 됩니다.

스크리닝 방문: 모든 환자는 데이터 수집 전에 정보에 입각한 동의서에 서명합니다. 환자 인구 통계가 기록됩니다. 대변 ​​배양 및 현미경 검사, 혈압(BP), 전혈구 수(FBC), 적혈구 침강 속도(ESR), C 반응성 단백질(CRP), 요소, 전해질(U&E) 및 GFR을 각 부위에서 현지에서 채취하여 측정합니다. . 이러한 검사 결과는 검토를 위해 수집 후 3일 이내에 Fremantle 병원의 중앙 사이트로 팩스로 전송됩니다. 대변 ​​칼프로텍틴을 채취하여 -200C에서 보관합니다. 이 표본은 분석을 위해 3개월마다 드라이아이스에 배치되어 Fremantle 병원의 중앙 사이트로 보내집니다.

0주 전 7일 이내에 유연한 S상 결장경 검사가 수행됩니다. 두 세트의 사진은 내시경에서 한 세트는 원위부(항문에서 15cm 이내)와 한 세트는 근위부(항문에서 15-25cm)에서 촬영됩니다. 더 나쁜 수준의 염증을 묘사하는 영역은 조직학적 분석을 위해 각 영역에서 2개의 생검을 채취할 것입니다. 생검은 각 병원 현장에서 고정 및 차단됩니다. 모든 파라핀 블록은 Fremantle 병원으로 보내집니다. 조직학적 분석을 위해 사진을 따릅니다. RNA 분리를 위해 각 지역에서 4개의 추가 생검을 할 것입니다. 각 지역의 생검은 즉시 RNAlater가 포함된 '근위' 및 '원위' 라벨이 붙은 2개의 튜브에 넣고 -80oC에 보관됩니다. 그런 다음 분석을 위해 3개월마다 드라이아이스에 배치되어 Fremantle 병원의 중앙 사이트로 보내집니다. 활성 UC의 존재를 확인하기 위해 전체 Mayo 점수가 계산됩니다(포함하려면 6~12 사이의 Mayo 점수 필요).

0주차: Mayo 점수는 스크리닝 내시경 소견 및 시작된 치료를 사용하여 계산됩니다. 기준선 IBDQ 계산 및 BP 측정

2주 및 4주차: 위에서 설명한 대로 수정된 Mayo 점수가 계산되고 BP가 측정되며 FBC, ESR, CRP, U&E 및 IBDQ가 평가됩니다. 대변 ​​칼프로텍틴을 채취하여 -200C에서 보관합니다. 타크로리무스 여물통에 대한 혈액을 채취하고 혈청을 수집하여 -20oC에 보관합니다. 그런 다음 수집 후 2일 이내에 평가를 위해 혈청을 드라이아이스에 담아 Fremantle 병원의 중앙 사이트로 보냅니다. Fremantle 병원의 의료 모니터(CIA)는 환자의 안전을 보장하기 위해 모든 타크로리무스 최저 수준을 검토합니다.

8주차 또는 철회: 8주차 방문의 ± 3일(또는 조기 철회 시)에 유연한 S상 결장경 검사를 수행하고 전체 Mayo 점수를 계산합니다. 선별 구불창자경 검사에서 자세히 설명된 대로 사진과 생검을 촬영하고 처리합니다. 일상적인 FBC, U&E, ESR, CRP, BP 측정 및 위에서 설명한 대변 칼프로텍틴

12주차: 부작용을 평가하기 위한 후속 전화 통화. 각 조직학적 표본은 맹검 전문 위장병 조직병리학자에 의해 Fremantle 병원에서 중앙 집중적으로 평가됩니다. 이러한 소견은 내시경 스코어링 및 내시경에서 촬영한 사진과 상관관계가 있습니다.

연구 조기 철회: 환자는 언제든지 연구를 철회할 수 있습니다. 환자가 0주차 방문 후 4주 이상 연구 준비의 효능 부족으로 인해 중단하는 경우, 4주 동안 오픈 라벨 사용 국소 타크로리무스 연고를 사용할 수 있습니다. 국소 타크로리무스 연고를 공급하기 전에 철회 가능한 구불창자경검사가 필요합니다. 0주 및 8주 절차에 대해 기술된 바와 같이 생검 전에 사진을 찍을 것입니다. 일상적인 FBC, U&E, ESR, CRP, BP 측정, 타크로리무스 최저 수치 및 대변 칼프로텍틴은 위에서 설명한 대로 치료 2주 후에 복용합니다. 이 환자들은 1차 및 2차 평가변수 분석에 적합합니다.

중간 분석: 20명의 환자가 8주간의 방문을 마친 후 독립적인 통계학자 및 임상의에 의한 중간 분석을 통해 약물의 안전성을 확인하고 효능을 평가할 예정입니다. 이는 연구가 계속되도록 허용하기 전에 필요합니다.

mRNA 발현 수준: 원위 결장에 대한 두 영역(항문에서 15cm 이내 및 항문에서 15-25cm 이내)에서 채취한 생검(x4). 0주 및 8주(또는 조기 중단 시)에 내시경 검사에서 보이는 더 심한 염증을 포함하는 영역이 기록될 것입니다. 모든 샘플은 나중에 RNA에 즉시 배치되고 프리맨틀 병원의 중앙 사이트로 드라이아이스로 옮기기 전에 -800C에서 보관됩니다. TNFα, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL4, IL-10 및 IL-6 mRNA 발현 수준은 샘플의 각 그룹에서 결정됩니다. Qiagen 96 RNeasy® 키트(Qiagen, Clifton Hill, Australia)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 총 RNA를 분리하고 DNase 처리합니다. RNA 샘플의 품질을 확인하고 역전사를 수행하며 ABI PRISM 7900HT(Applied Biosystems)에서 QuantiTect SYBR Green Master Mix(Qiagen)를 사용하여 실시간 PCR로 cDNA를 정량합니다. mRNA에 대한 특정 프라이머가 사용됩니다. 해리 곡선 분석은 증폭의 특이성을 확인하고 카피 수는 플라스미드 또는 PCR 제품 표준 곡선에서 결정됩니다. 표적 mRNA 카피 수는 각 cDNA 샘플에 대한 참조 유전자 카피 수에 대해 정규화됩니다. 위의 방법은 Fremantle 병원의 CIA 연구소에서 이미 사용할 수 있습니다. mRNA 검출 한계는 모든 사이토카인에 대해 3pg/ml입니다.

통계적 분석: 타크로리무스 치료 부문에서 0주 및 8주(또는 중단 시)에 취한 내시경 생검에서 mRNA 발현 간의 비교를 수행하고 동일한 시점에서 위약 대조 부문의 mRNA 발현과 서로 비교합니다. mRNA 발현 수준은 내시경 및 조직학적 염증 점수와 상관관계가 있을 것입니다. 그룹 간의 차이는 로그 변환 데이터에 대한 일원 분산 분석을 사용하여 평가됩니다. 통계 분석은 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences) 버전 17을 사용하여 수행됩니다. 통계적 유의성은 모든 분석에서 p<0.05로 간주됩니다.