直肠他克莫司治疗难治性溃疡性直肠炎

炎症性肠病 (IBD) 是一种终生疾病，通常在 15 至 35 岁之间被诊断出来，而且发病率正在增加。 在发达国家，2002 年 IBD 患病率约为 100-220/100,000。 最近，美国 CD 和 UC 的估计患病率分别为每 100,000 人 201 人和 238 人。 这表明仅在美国就有超过 620,000 名 CD 和 730,000 名 UC 患者。 还注意到，在过去的二十年中，IBD 在美国少数民族中的发病率一直在增加，并且据预测，以前被认为是“高加索疾病”的 IBD 将在亚洲达到相当的水平就像在 10-15 年内的西方国家一样。 IBD 治疗的主要费用之一是需要住院。 由于越来越多地使用生物疗法，CD 患者的入院人数一直在下降，但是，在过去 15 年中，UC 的入院人数翻了一番。 IBD 现在每年给 22,000,000 人的澳大利亚经济造成超过 27 亿美元的损失，这在整个西方世界都是可比的。

他克莫司和环孢菌素是经典的神经钙蛋白抑制剂，被广泛用作免疫抑制药物，在 UC 中取得了可喜的成果。 钙调神经磷酸酶或蛋白磷酸酶 2B (PP2B) 是一种普遍表达的细胞溶质 Ser/Thr 蛋白磷酸酶，在真核生物中高度保守。 它具有使多种蛋白质去磷酸化的能力，可以调节白细胞介素 (IL)-2、IL-4 和干扰素 (IFN)γ 的表达，以及调节 NF-κB 等转录因子的活性。 增强的 NF-kB 活性在 CD 和 UC 中得到了很好的描述，并诱导促炎细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNFα 的表达。 主要是通过降低这些细胞因子的水平，可以实现临床缓解。

口服他克莫司的疗效已在耐药 CD 和 UC 的管理中得到检验。 不幸的是，这些研究中的大多数都是开放标签的，只有一项在加州大学报告的随机对照试验。 这证明了短期的临床改善，但缓解率没有显着增加，这可能是由于患者数量少。 尽管如此，在 UC 和 CD 中仍有许多开放标记研究表明短期疗效和有希望的长期数据。 然而，有证据表明，血谷水平应至少为 10ug/L 才能达到最佳疗效（治疗范围 5-20ug/L），但谷水平越高，患者就越有可能遭受负面影响。 不幸的是，这些疾病可能很多，包括高血压、恶心和腹泻、血液学异常、肾功能损害。 皮肤癌发病率的增加也是一个问题，这一问题得到了动物研究的支持。

局部使用他克莫司可有效治疗小儿 CD 患者的口周和会阴炎症，75% 的症状得到缓解。 在成人 CD 患者中检查局部肛周他克莫司治疗的工作也证明了临床疗效，尽管他克莫司透皮吸收良好，但在血液中仅检测到低谷水平的他克莫司。 在这些初步研究中，外用他克莫司的副作用很少。 与口服制剂一样，长期局部使用可能会增加患皮肤癌的风险。 然而，流行病学证据表明风险很低，并且局限于接受他克莫司治疗的暴露在阳光下的皮肤。

我们小组最近的初步研究表明，75% (6/8) 的耐药性远端结肠炎患者在使用他克莫司直肠软膏 4 周和 8 周后有反应并获得疾病缓解8。 在大多数患者中确定每天两次 0.3 至 0.5mg/ml 3ml 的剂量可诱导缓解。 在这些患者中，定期测定他克莫司的谷浓度，并且检测不到 (<1.5 μg/L) 低于治疗水平 (<5 μg/L)，或者处于低治疗范围（治疗范围 5-20 μg/L）的最高水平). 该药膏耐受性良好，没有任何全身不良反应。 在另外 8 名患者中使用相同的直肠他克莫司制剂也与治疗 4 周后 6 名患者的临床反应相关。

外用他克莫司在 UC 中的疗效得到了一项单独的试点研究的进一步支持，该研究检查了难治性远端结肠炎患者的外用他克莫司。 在这项研究中，12 名患者中的 10 名在 4 周内出现了临床和组织学改善，没有任何重大副作用的报告，并且该制剂耐受性良好。

方法

研究药物和供应：他克莫司直肠软膏的制备将在每个中心各自的医院药房进行。 准备时应戴手套和口罩。 软膏中他克莫司的浓度应为 0.5 mg⁄mL。 在干净的玻璃板上，将五毫升丙二醇缓慢混合到所需量的他克莫司粉末中。 为此，将通过系列稀释和研磨逐渐加入 70 mL 石蜡液体 BP (LP)，直至混合均匀。 将使用 125 mL 石蜡白软 BP (WSP) 重复此过程。 由此产生的奶油将被装入管中并贴上标签。 该制剂将使用 LP ⁄WSP 基质配制，以​​便于直肠使用。

药物稳定性：乳膏在室温下 30 天或 4-8 0C 下 90 天后失效

研究药物的给药：在 8 周的时间内，患者每天两次通过涂药器直肠施用总共 3ml 的研究药物或安慰剂。 申请将在就寝前和早餐后进行。 对于轮班工人，申请将在就寝前和一天中的第一顿饭后进行。

剂量表：

1. 随机化：患者将以 1:1 的比例随机分配接受他克莫司或安慰剂。
2. 盲法：试验患者和临床研究者将对随机分组不知情。

伴随治疗：直肠准备将在开始试验前一天停止。 患者将继续服用与研究开始时相同的口服药物。

筛选访问：所有患者将在收集任何数据之前签署知情同意书。 将记录患者的人口统计数据。 粪便培养和显微镜检查、血压 (BP)、全血细胞计数 (FBC)、红细胞沉降率 (ESR)、C 反应蛋白 (CRP)、尿素、电解质 (U&E) 和 GFR 将在每个站点进行本地测量. 这些测试的结果将在收集后 3 天内传真到弗里曼特尔医院的中心站点以供审查。 粪便钙卫蛋白将被取出并储存在-200C。 这些标本将每 3 个月用干冰分批送往弗里曼特尔医院的中心站点进行分析。

在第 0 周之前的 7 天内，将进行可弯曲的乙状结肠镜检查。 在内窥镜检查时将拍摄两组照片，一组在远端（距肛门 15 厘米以内），一组在近端（距肛门 15-25 厘米）。 描述较差炎症水平的区域将从每个区域进行 2 次活组织检查以进行组织学分析。 活检将在每个医院地点进行固定和封锁。 所有石蜡块将被送往 Fremantle 医院并注明。 按照照片进行组织学分析。 将从每个区域进行四次额外的活组织检查以进行 RNA 分离。 来自每个区域的活组织检查将立即放入标有“近端”和“远端”的 2 个管中，其中含有 RNAlater，并储存在 -80oC。 然后每 3 个月将这些样本用干冰分批送到弗里曼特尔医院的中心站点进行分析。 将计算完整的 Mayo 评分以确认活动性 UC 的存在（纳入所需的 Mayo 评分在 6 到 12 之间）。

第 0 周：将使用筛查内窥镜检查结果和开始的治疗来计算 Mayo 评分。 基线 IBDQ 计算和 BP 测量

第 2 周和第 4 周：将计算修改后的 Mayo 评分，采集 BP，并如上所述进行 FBC、ESR、CRP、U&E，并评估 IBDQ。 粪便钙卫蛋白将被取出并储存在-200℃。 将采集用于他克莫司槽的血液，收集血清并将其储存在-20oC。 然后，血清将在干冰上被送到弗里曼特尔医院的中心站点，在收集后 2 天内进行评估。 弗里曼特尔医院的医学监测员 (CIA) 将审查所有他克莫司的谷浓度，以确保患者安全。

第 8 周或退出：将在第 8 周访问（或提前退出）的 ± 3 天内进行可弯曲乙状结肠镜检查，并计算完整的 Mayo 评分。 将按照筛查乙状结肠镜检查中的详细说明拍摄和处理照片和活组织检查。 如上所述的常规 FBC、U&E、ESR、CRP、血压测量和粪便钙卫蛋白

第 12 周：后续电话评估任何不良事件。 每个组织学标本将由一位不知情的胃肠病学组织病理学家在弗里曼特尔医院集中评估。 这些发现将与内窥镜评分和内窥镜拍摄的照片相关联。

提前退出研究：患者可以随时退出研究。 如果患者在第 0 周就诊后 4 周或更长时间由于研究准备无效而退出，他们将有资格使用开放标签使用外用他克莫司软膏 4 周。 在供应外用他克莫司软膏之前，需要进行可屈式乙状结肠镜检查。 如第 0 周和第 8 周程序所述，将在活组织检查之前拍摄照片。 如上所述，在治疗 2 周后，将进行常规 FBC、U&E、ESR、CRP、BP 测量、他克莫司谷水平和粪便钙卫蛋白。 这些患者将有资格进行主要和次要终点分析

中期分析：在 20 名患者完成为期 8 周的访问后，将由独立统计学家和临床医生进行中期分析，以确认药物安全性并评估疗效。 在允许研究继续之前，这应该是必需的。

mRNA 表达水平：从远端结肠的两个区域（肛门 15 厘米以内和肛门 15-25 厘米以内）获取的活组织检查 (x4)。 包含在第 0 周和第 8 周（或早期停药时）内窥镜检查中发现的更严重炎症的区域将被注意到。 所有样品稍后将立即置于 RNA 中并储存在 -800C 下，然后用干冰转移到弗里曼特尔医院的中心部位。 将测定每组样品的 TNFα、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL4、IL-10 和 IL-6 mRNA 表达水平。 根据制造商的说明，使用 Qiagen 96 RNeasy® 试剂盒（Qiagen, Clifton Hill, Australia）分离总 RNA 并进行 DNase 处理。 在 ABI PRISM 7900HT（Applied Biosystems）上使用 QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）通过实时 PCR 验证 RNA 样本的质量、执行逆转录和定量 cDNA。 将使用 mRNA 的特异性引物。 解离曲线分析将确认扩增的特异性，拷贝数将从质粒或 PCR 产物标准曲线确定。 目标 mRNA 拷贝数将根据每个 cDNA 样本的参考基因拷贝数进行标准化。 上述方法在中央情报局位于弗里曼特尔医院的实验室中已经可用。 所有细胞因子的 mRNA 检测限为 3pg/ml

统计分析：将对他克莫司治疗组在第 0 周和第 8 周（或停药时）进行的内窥镜活检中的 mRNA 表达进行比较，并相互比较，并与安慰剂对照组在同一时间点进行比较。 mRNA 表达水平将与内窥镜和组织学炎症评分相关联。 将使用对数转换数据的单向方差分析来评估组之间的差异。 将使用社会科学统计软件包 (SPSS) 第 17 版进行统计分析。统计显着性被认为是所有分析的 p<0.05。