Ректальный такролимус в лечении резистентного язвенного проктита

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) — это пожизненные состояния, часто диагностируемые в возрасте от 15 до 35 лет, частота которых увеличивается. В развитых странах распространенность ВЗК в 2002 году составляла около 100-220/100 000. Совсем недавно оценочная распространенность БК и ЯК в США составляла 201 и 238 на 100 000 соответственно. Это указывает на более чем 620 000 случаев БК и 730 000 пациентов с ЯК только в США. Также было отмечено, что заболеваемость ВЗК среди этнических меньшинств в Америке за последние два десятилетия увеличилась, и прогнозируется, что ВЗК, которое ранее считалось «кавказской болезнью», достигнет сопоставимого уровня в Азии. как и в странах Запада в течение 10-15 лет. Одной из основных статей расходов при лечении ВЗК является необходимость госпитализации. Они снижаются для пациентов с болезнью Крона из-за более широкого использования биологической терапии, однако за последние 15 лет число госпитализаций по поводу язвенного колита удвоилось. В настоящее время ВЗК обходится австралийской экономике с населением 22 000 000 человек более чем в 2,7 миллиарда долларов в год, и это сопоставимо во всем западном мире.

Такролимус и циклоспорин являются классическими ингибиторами кальциневрина и широко используются в качестве иммунодепрессантов с многообещающими результатами при ЯК. Кальциневрин, или протеинфосфатаза 2B (PP2B), представляет собой повсеместно экспрессируемую цитозольную Ser/Thr протеинфосфатазу, которая высоко консервативна у эукариот. Он обладает способностью дефосфорилировать широкий спектр белков и может регулировать экспрессию интерлейкина (IL)-2, IL-4 и интерферона (IFN)γ, а также модулировать активность факторов транскрипции, таких как NF-κB. Повышенная активность NF-kB хорошо описана при БК и ЯК и индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и TNFα. В первую очередь за счет снижения уровней этих цитокинов может быть достигнута клиническая ремиссия.

Эффективность перорального такролимуса изучалась при лечении резистентных к лекарствам БК и ЯК. К сожалению, большинство этих исследований были открытыми, и только в одном рандомизированном контролируемом исследовании сообщалось о НЯК. Это продемонстрировало краткосрочное клиническое улучшение, но без значительного увеличения частоты ремиссий, возможно, из-за небольшого числа пациентов. Несмотря на это, существуют многочисленные открытые исследования как при ЯК, так и при БК, которые предполагают краткосрочную эффективность и многообещающие долгосрочные данные. Однако данные свидетельствуют о том, что минимальный уровень в крови должен быть не менее 10 мкг/л для достижения наилучшей эффективности (терапевтический диапазон 5-20 мкг/л), но чем выше минимальный уровень, тем больше вероятность того, что пациент будет страдать вредное влияние. К сожалению, они могут быть многочисленными и включают гипертонию, тошноту и диарею, гематологические нарушения, почечную недостаточность. Рост заболеваемости раком кожи также вызывает беспокойство, и это подтверждается исследованиями на животных.

Использование местного такролимуса оказалось эффективным при лечении периорального и промежностного воспаления у детей с БК с исчезновением симптомов в 75%. Работа по изучению местной перианальной терапии такролимусом у взрослых пациентов с болезнью Крона также продемонстрировала клиническую эффективность, и, хотя такролимус хорошо всасывается чрескожно, в крови были обнаружены только низкие минимальные уровни такролимуса. В этих предварительных исследованиях местное применение такролимуса было связано с очень небольшим количеством побочных эффектов. Длительное местное применение, как и пероральные препараты, может быть связано с повышенным риском образования рака кожи. Эпидемиологические данные, однако, предполагают, что риск низок и локализован на коже, подвергаемой воздействию такролимуса, на солнце.

Недавнее пилотное исследование, проведенное нашей группой, показало, что 75% (6/8) пациентов с резистентным дистальным колитом ответили и достигли ремиссии заболевания после 4 и 8 недель применения ректальной мази такролимуса8. Доза от 0,3 до 0,5 мг/мл 3 мл два раза в день была определена у большинства пациентов для достижения ремиссии. У этих пациентов минимальные уровни такролимуса измерялись регулярно и были либо неопределяемыми (<1,5 мкг/л), субтерапевтическими (<5 мкг/л), либо, в максимальной степени, низкими терапевтическими уровнями (терапевтический диапазон 5–20 мкг/л). ). Мазь хорошо переносилась без каких-либо системных побочных эффектов. Использование того же ректального препарата такролимуса еще у 8 пациентов также ассоциировалось с клиническим ответом у 6 пациентов через 4 недели терапии.

Эффективность местного применения такролимуса при ЯК дополнительно подтверждается отдельным пилотным исследованием, в котором изучалось местное применение такролимуса у пациентов с резистентным дистальным колитом. В этом исследовании сообщалось о клиническом и гистологическом улучшении у 10 из 12 пациентов через 4 недели без каких-либо серьезных побочных эффектов, и препарат хорошо переносился.

МЕТОДОЛОГИЯ

Исследуемое лекарство и поставка: Приготовление ректальной мази такролимуса будет осуществляться в соответствующей больничной аптеке в каждом центре. При приготовлении препарата необходимо надевать перчатки и маску. Концентрация такролимуса в мази должна составлять 0,5 мг/мл. Пять миллилитров пропиленгликоля медленно смешивают с желаемым количеством порошка такролимуса на чистой стеклянной пластине. К этому постепенно добавляют 70 мл жидкого парафина BP (LP) путем серийного разбавления и растирания до однородного смешивания. Этот процесс будет повторяться с 125 мл парафина белого мягкого BP (WSP). Полученный крем будет упакован в тубы и промаркирован. Препарат будет составлен с использованием основы LP/WSP для простоты ректального применения.

Стабильность препарата: Срок годности крема составляет 30 дней при комнатной температуре или 90 дней при 4-8 0С.

Введение исследуемого препарата: в общей сложности 3 мл исследуемого препарата или плацебо будут наноситься пациентом ректально через аппликатор два раза в день в течение 8-недельного периода. Применение будет иметь место перед отходом ко сну и после завтрака утром. Для сменных рабочих применение будет происходить непосредственно перед отходом ко сну и после первого приема пищи в течение дня.

График дозирования:

1. Рандомизация: пациенты будут случайным образом распределены в соотношении 1:1 для получения такролимуса или плацебо.
2. Ослепление: пациенты, проводящие испытания, и клинические исследователи не будут осведомлены о рандомизации.

Сопутствующая терапия: ректальная подготовка будет прекращена за день до начала исследования. Пациенты будут продолжать принимать те же пероральные препараты, которые они принимали в начале исследования.

Визит для скрининга: все пациенты подписывают информированное согласие до сбора данных. Будут записаны демографические данные пациентов. Посев кала и микроскопия, кровяное давление (АД), общий анализ крови (ОАК), скорость оседания эритроцитов (СОЭ), С-реактивный белок (СРБ), мочевина, электролиты (УиЭ) и СКФ будут взяты и измерены локально в каждом месте . Результаты этих тестов будут отправлены по факсу на центральный пункт в больнице Фримантл в течение 3 дней после получения для рассмотрения. Фекальный кальпротектин берут и хранят при температуре -20°С. Эти образцы будут отправлять партиями на сухом льду каждые 3 месяца в центральный центр больницы Фримантл для анализа.

В течение 7 дней до недели 0 будет выполнена гибкая ректороманоскопия. Во время эндоскопии будет сделано два набора фотографий: один дистальнее (в пределах 15 см от ануса), а другой — проксимально (15–25 см от ануса). В области, изображающей худший уровень воспаления, будут взяты 2 биоптата из каждой области для гистологического анализа. Биопсии будут зафиксированы и заблокированы в каждой больнице. Все парафиновые блоки будут отправлены в больницу Фримантл. Далее фото для гистологического анализа. Четыре дополнительных биопсии будут взяты из каждой области для выделения РНК. Биоптаты из каждой области будут немедленно помещены в 2 пробирки, помеченные как «проксимальные» и «дистальные», содержащие RNAlater, и будут храниться при температуре -80oC. Затем они будут отправляться партиями на сухом льду каждые 3 месяца в центральный центр больницы Фримантл для анализа. Для подтверждения наличия активного язвенного колита будет рассчитана полная оценка Мейо (для включения требуется оценка по шкале Мейо от 6 до 12).

Неделя 0: оценка по шкале Мейо будет рассчитана с использованием результатов эндоскопического скрининга и начала лечения. Расчет исходного уровня IBDQ и измерение АД

Недели 2 и 4: Будет рассчитана модифицированная оценка Мейо, измерено АД, а также ОАК, СОЭ, СРБ, U&E, как описано выше, и оценен IBDQ. Фекальный кальпротектин берут и хранят при -20°С. Будет взята кровь для корыта с такролимусом, собрана сыворотка, которая будет храниться при -20oC. Затем сыворотка будет отправлена ​​на сухом льду в центральный центр больницы Фримантл для оценки в течение 2 дней после сбора. Медицинский монитор (CIA) в больнице Фримантл проверит все уровни такролимуса в желобе, чтобы обеспечить безопасность пациента.

8-я неделя или отмена: будет проведена гибкая сигмоидоскопия ± 3 дня визита на 8-й неделе (или при раннем отмене) и будет рассчитана полная оценка по шкале Мейо. Фотографии и биопсии будут сделаны и обработаны, как указано на скрининговой ректороманоскопии. Обычные ОСК, U&E, СОЭ, СРБ, измерение АД и фекальный кальпротектин, как описано выше.

Неделя 12: Последующий телефонный звонок для оценки любых нежелательных явлений. Каждый гистологический образец будет оцениваться централизованно в больнице Фримантл слепым специалистом-гастроэнтерологом-патологом. Эти результаты будут коррелированы с эндоскопической оценкой и фотографиями, сделанными при эндоскопии.

Досрочный выход из исследования: пациенты могут выйти из исследования в любое время. Если пациент выбывает из исследования из-за отсутствия эффективности исследуемого препарата через 4 недели или более после визита на неделе 0, он будет иметь право на открытое использование мази такролимуса для местного применения в течение 4 недель. Перед нанесением мази такролимуса для местного применения потребуется гибкая сигмоидоскопия с отменой. Фотографии будут сделаны до биопсии, как описано для процедур 0 и 8 недель. Обычные ОАК, УиЭ, СОЭ, СРБ, измерение АД, минимальные уровни такролимуса и фекальный кальпротектин будут приниматься через 2 недели терапии, как описано выше. Эти пациенты будут иметь право на анализ первичных и вторичных конечных точек.

Промежуточный анализ: Промежуточный анализ, проведенный независимым статистиком и клиницистом после того, как 20 пациентов завершили 8-недельный визит, будет проведен для подтверждения безопасности препарата и оценки эффективности. Это необходимо, прежде чем разрешить продолжение исследования.

Уровни экспрессии мРНК: биопсии (x4), взятые из двух областей дистального отдела толстой кишки (в пределах 15 см от ануса и 15-25 см от ануса). Будет отмечена область, содержащая более выраженное воспаление, наблюдаемое при эндоскопическом исследовании на 0-й и 8-й неделе (или при ранней отмене). Все образцы будут немедленно помещены в РНК позже и сохранены при -800C до передачи на сухом льду в центральный центр в больнице Фримантл. Уровни экспрессии мРНК TNFα, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL4, IL-10 и IL-6 будут определяться в каждой группе образцов. Общая РНК будет выделена и обработана ДНКазой с использованием набора Qiagen 96 RNeasy® (Qiagen, Clifton Hill, Australia) в соответствии с инструкциями производителя. Будет проверено качество образцов РНК, выполнена обратная транскрипция и проведена количественная оценка кДНК с помощью ПЦР в реальном времени с использованием QuantiTect SYBR Green Master Mix (Qiagen) на ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Будут использоваться специфические праймеры для мРНК. Анализ кривой диссоциации подтвердит специфичность амплификации, а число копий будет определено по стандартным кривым плазмиды или продукта ПЦР. Целевые числа копий мРНК будут нормализованы относительно числа копий эталонного гена для каждого образца кДНК. Вышеупомянутые методы уже доступны в лаборатории ЦРУ в больнице Фримантл. Предел обнаружения мРНК для всех цитокинов составляет 3 пг/мл.

Статистический анализ: будет проведено сравнение между экспрессией мРНК в эндоскопических биопсиях, взятых на 0-й и 8-й неделе (или при отмене) в группе лечения такролимусом, и будет проведено сравнение друг с другом и с экспрессией в группе плацебо в те же моменты времени. Уровни экспрессии мРНК будут коррелировать с эндоскопическими и гистологическими показателями воспаления. Различия между группами будут оцениваться с использованием однофакторного ANOVA на логарифмически преобразованных данных. Статистический анализ будет проводиться с использованием Статистического пакета для социальных наук (SPSS) версии 17. Статистическая значимость считается p<0,05 для всех анализов.