Takrolimus doodbytniczy w leczeniu opornego wrzodziejącego zapalenia odbytnicy

Choroby zapalne jelit (IBD) to choroby trwające całe życie, często diagnozowane między 15 a 35 rokiem życia, których częstotliwość wzrasta. W krajach rozwiniętych częstość występowania IBD wynosiła około 100-220/100 000 w 2002 roku. Niedawno szacowana częstość występowania CD i UC w USA wynosi odpowiednio 201 i 238 na 100 000. Wskazuje to na ponad 620 000 pacjentów z CD i 730 000 pacjentów z UC w samych Stanach Zjednoczonych. Zauważono również, że częstość występowania IBD wzrastała wśród mniejszości etnicznych w Ameryce w ciągu ostatnich dwóch dekad i przewiduje się, że IBD, które wcześniej uważano za „chorobę kaukaską”, osiągnie porównywalny poziom w Azji jak w krajach zachodnich w ciągu 10-15 lat. Jednym z głównych kosztów leczenia NZJ jest konieczność hospitalizacji. Spadały one u pacjentów z CD w wyniku coraz częstszego stosowania terapii biologicznych, jednak liczba przyjęć z powodu UC podwoiła się w ciągu ostatnich 15 lat. IBD kosztuje obecnie australijską gospodarkę liczącą 22 000 000 ludzi ponad 2,7 miliarda dolarów rocznie i jest to porównywalne w całym zachodnim świecie.

Takrolimus i cyklosporyna są klasycznymi inhibitorami kalcyneuryny i są szeroko stosowane jako leki immunosupresyjne z obiecującymi wynikami w leczeniu UC. Kalcyneuryna, czyli fosfataza białkowa 2B (PP2B), jest wszechobecną cytozolową fosfatazą białkową Ser/Thr, która jest wysoce konserwatywna u eukariontów. Ma zdolność defosforylacji szerokiego zakresu białek i może regulować ekspresję interleukiny (IL)-2, IL-4 i interferonu (IFN)γ, a także modulować aktywność czynników transkrypcyjnych, takich jak NF-κB. Zwiększona aktywność NF-kB jest dobrze opisana w CD i UC i indukuje ekspresję cytokin prozapalnych IL-1β, IL-6 i TNFα. Remisję kliniczną można osiągnąć głównie poprzez obniżenie poziomu tych cytokin.

Skuteczność doustnego takrolimusu została zbadana w leczeniu lekoopornych CD i UC. Niestety, większość z tych badań była otwarta, a tylko jedno randomizowane badanie z grupą kontrolną zostało zgłoszone w UC. Wykazało to krótkoterminową poprawę kliniczną, ale bez znaczącego wzrostu odsetka remisji, potencjalnie z powodu małej liczby pacjentów. Mimo to istnieje wiele otwartych badań dotyczących zarówno wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, jak i celiakii, które sugerują skuteczność w krótkim okresie i zawierają obiecujące dane długoterminowe. Dowody sugerują jednak, że minimalny poziom we krwi powinien wynosić co najmniej 10 ug/l, aby osiągnąć najlepszą skuteczność (zakres terapeutyczny 5-20 ug/l), ale im wyższy poziom minimalny, tym bardziej prawdopodobne jest, że pacjent będzie cierpiał niekorzystny efekt. Tych niestety może być wiele i obejmują nadciśnienie, nudności i biegunki, nieprawidłowości hematologiczne, zaburzenia czynności nerek. Niepokój budzi również wzrost zachorowań na raka skóry, który potwierdzają badania na zwierzętach.

Miejscowe stosowanie takrolimusu było skuteczne w leczeniu zapalenia okołoustnego i krocza u dzieci i młodzieży z CD, z ustąpieniem objawów w 75%. Badania nad miejscową terapią okołoodbytniczą takrolimusem u dorosłych pacjentów z CD również wykazały skuteczność kliniczną i chociaż takrolimus jest dobrze wchłaniany przezskórnie, we krwi wykryto jedynie niskie minimalne poziomy takrolimusu. W tych wstępnych badaniach miejscowe stosowanie takrolimusu wiązało się z bardzo nielicznymi działaniami niepożądanymi. Długotrwałe stosowanie miejscowe, podobnie jak preparaty doustne, może wiązać się ze zwiększonym ryzykiem powstawania raka skóry. Dowody epidemiologiczne sugerują jednak, że ryzyko jest niskie i ograniczone do skóry narażonej na działanie promieni słonecznych, leczonej takrolimusem.

Niedawne badanie pilotażowe przeprowadzone przez naszą grupę wykazało, że 75% (6/8) pacjentów z opornym zapaleniem dystalnej części jelita grubego zareagowało i osiągnęło remisję choroby po 4 i 8 tygodniach stosowania takrolimusu w maści doodbytniczej8. U większości pacjentów zidentyfikowano dawkę od 0,3 do 0,5 mg/ml 3 ml dwa razy na dobę w celu wywołania remisji. U tych pacjentów minimalne stężenia takrolimusu były przyjmowane regularnie i były albo niewykrywalne (<1,5 μg/l), subterapeutyczne (<5 μg/l), albo najwyższe w niskim zakresie terapeutycznym (zakres terapeutyczny 5-20 μg/l). ). Maść była dobrze tolerowana bez ogólnoustrojowych działań niepożądanych. Zastosowanie tego samego preparatu takrolimusu doodbytniczego u kolejnych 8 pacjentów wiązało się również z odpowiedzią kliniczną u 6 pacjentów po 4 tygodniach terapii.

Skuteczność miejscowego stosowania takrolimusu w UC jest dodatkowo poparta oddzielnym badaniem pilotażowym, w którym oceniano miejscowe stosowanie takrolimusu u pacjentów z opornym dystalnym zapaleniem jelita grubego. W badaniu tym stwierdzono poprawę kliniczną i histologiczną u 10 z 12 pacjentów w ciągu 4 tygodni bez żadnych poważnych skutków ubocznych, a preparat był dobrze tolerowany.

METODOLOGIA

Badany lek i zaopatrzenie: Przygotowanie takrolimusu w maści doodbytniczej zostanie przeprowadzone w odpowiedniej aptece szpitalnej w każdym ośrodku. Podczas przygotowywania preparatu należy nosić rękawiczki i maskę. Stężenie takrolimusu w maści powinno wynosić 0,5 mg/ml. Pięć mililitrów glikolu propylenowego należy powoli wymieszać z żądaną ilością proszku takrolimusu na czystej szklanej płytce. Do tego stopniowo doda się 70 ml płynnej parafiny BP (LP) przez seryjne rozcieńczanie i rozciera aż do równomiernego wymieszania. Ten proces zostanie powtórzony z użyciem 125 ml białej parafiny miękkiej BP (WSP). Powstały krem ​​zostanie zapakowany w tuby i oznakowany. Preparat zostanie sformułowany przy użyciu bazy LP ⁄WSP w celu ułatwienia stosowania doodbytniczego.

Stabilność leku: Krem traci ważność po 30 dniach w temperaturze pokojowej lub 90 dniach w temperaturze 4-8 0C

Podawanie badanego leku: Łącznie 3 ml badanego leku lub placebo będzie podawane doodbytniczo za pomocą aplikatora dwa razy dziennie przez pacjenta przez okres 8 tygodni. Aplikacja będzie miała miejsce przed pójściem spać i rano po śniadaniu. W przypadku pracowników zmianowych aplikacja nastąpi tuż przed pójściem spać i po pierwszym posiłku w ciągu dnia.

Schemat dawkowania:

1. Randomizacja: Pacjenci zostaną losowo przydzieleni w stosunku 1:1 do grup otrzymujących takrolimus lub placebo.
2. Zaślepienie: Pacjenci biorący udział w badaniu i badacze kliniczni zostaną zaślepieni co do randomizacji.

Terapia towarzysząca: Preparat doodbytniczy zostanie zakończony na dzień przed rozpoczęciem badania. Pacjenci będą nadal otrzymywać te same leki doustne, które przyjmowali na początku badania.

Wizyta przesiewowa: wszyscy pacjenci podpiszą świadomą zgodę przed zebraniem jakichkolwiek danych. Dane demograficzne pacjentów zostaną zarejestrowane. Posiew kału i mikroskopia, ciśnienie krwi (BP), pełna morfologia krwi (FBC), szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR), białko C-reaktywne (CRP), mocznik, elektrolity (U&E) i GFR zostaną pobrane i zmierzone lokalnie w każdym miejscu . Wyniki tych testów zostaną przesłane faksem do ośrodka centralnego w szpitalu Fremantle w ciągu 3 dni od pobrania do wglądu. Kalprotektyna w kale zostanie pobrana i przechowywana w -200C. Próbki te będą wysyłane partiami na suchym lodzie co 3 miesiące do centralnego ośrodka w szpitalu Fremantle w celu analizy.

W ciągu 7 dni przed tygodniem 0 zostanie przeprowadzona elastyczna sigmoidoskopia. Podczas endoskopii zostaną wykonane dwa zestawy zdjęć, jeden zestaw dystalny (w odległości 15 cm od odbytu) i jeden zestaw proksymalny (15-25 cm od odbytu). Region przedstawiający gorszy poziom zapalenia zostanie pobrany z każdego regionu po 2 biopsje do analizy histologicznej. Biopsje będą utrwalane i blokowane w każdym szpitalu. Wszystkie bloki parafinowe zostaną wysłane do szpitala Fremantle i zostaną odnotowane. Po zdjęciach do analizy histologicznej. Z każdego regionu zostaną pobrane cztery dodatkowe biopsje w celu izolacji RNA. Biopsje z każdego regionu zostaną natychmiast umieszczone w 2 probówkach oznaczonych jako „proksymalna” i „dystalna”, zawierających RNAlater i przechowywanych w temperaturze -80oC. Zostaną one następnie wysłane partiami na suchym lodzie co 3 miesiące do centralnej lokalizacji szpitala Fremantle w celu analizy. Pełny wynik Mayo zostanie obliczony w celu potwierdzenia obecności aktywnego UC (wynik Mayo między 6 a 12 wymagany do włączenia).

Tydzień 0: Punktacja Mayo zostanie obliczona na podstawie przesiewowych wyników badań endoskopowych i rozpoczętego leczenia. Obliczono wyjściowe IBDQ i zmierzono BP

Tydzień 2 i 4: Zostanie obliczony zmodyfikowany wynik Mayo, zmierzone BP oraz FBC, OB, CRP, U&E zgodnie z powyższym opisem oraz oceniona IBDQ. Kalprotektyna w kale zostanie pobrana i przechowywana w -200C. Zostanie pobrana krew do koryta z takrolimusem, pobrana zostanie surowica, która będzie przechowywana w temperaturze -20oC. Surowica zostanie następnie wysłana w suchym lodzie do centralnego ośrodka w szpitalu Fremantle w celu oceny w ciągu 2 dni od pobrania. Monitor medyczny (CIA) w szpitalu Fremantle dokona przeglądu wszystkich minimalnych poziomów takrolimusu, aby zapewnić bezpieczeństwo pacjentów.

Tydzień 8 lub odstawienie: Przeprowadzona zostanie elastyczna sigmoidoskopia ± 3 dni wizyty w 8. tygodniu (lub przy wczesnym odstawieniu) i obliczona zostanie pełna ocena Mayo. Zdjęcia i biopsje zostaną zrobione i przetworzone zgodnie z opisem w sigmoidoskopii przesiewowej. Rutynowe oznaczenie FBC, U&E, OB, CRP, BP i kalprotektyny w kale, jak opisano powyżej

Tydzień 12: Kontynuacja rozmowy telefonicznej w celu oceny ewentualnych zdarzeń niepożądanych. Każda próbka histologiczna zostanie oceniona centralnie w szpitalu Fremantle przez zaślepionego specjalistę histopatologa gastroenterologicznego. Wyniki te zostaną skorelowane z punktacją endoskopową i zdjęciami wykonanymi podczas endoskopii.

Wcześniejsze wycofanie się z badania: Pacjenci mogą wycofać się z badania w dowolnym momencie. Jeśli pacjent wycofuje się z badania z powodu braku skuteczności preparatu badanego 4 tygodnie lub dłużej po wizycie w tygodniu 0, będzie kwalifikował się do otwartego stosowania maści z takrolimusem do stosowania miejscowego przez 4 tygodnie. Przed podaniem miejscowej maści z takrolimusem konieczne będzie wykonanie elastycznej sigmoidoskopii odstawiennej. Zdjęcia zostaną zrobione przed biopsją, jak opisano dla procedur w tygodniu 0 i 8. Rutynowe FBC, U&E, OB, CRP, BP oznaczane, minimalne poziomy takrolimusu i kalprotektyna w kale zostaną zmierzone po 2 tygodniach terapii, jak opisano powyżej. Pacjenci ci będą kwalifikować się do analizy pod kątem pierwszorzędowych i drugorzędowych punktów końcowych

Analiza tymczasowa: Analiza tymczasowa przeprowadzona przez niezależnego statystyka i klinicystę po zakończeniu 8-tygodniowej wizyty 20 pacjentów zostanie przeprowadzona w celu potwierdzenia bezpieczeństwa leku i oceny skuteczności. Jest to wymagane przed zezwoleniem na kontynuację badania.

Poziomy ekspresji mRNA: Biopsje (x4) pobrane z dwóch regionów dystalnej części okrężnicy (w odległości 15 cm od odbytu i 15-25 cm od odbytu). Odnotowany zostanie region zawierający gorszy stan zapalny obserwowany w badaniu endoskopowym w tygodniach 0 i 8 (lub przy wczesnym odstawieniu). Wszystkie próbki zostaną później natychmiast umieszczone w RNA i przechowywane w temperaturze -80°C przed przeniesieniem na suchy lód do ośrodka centralnego w szpitalu Fremantle. W każdej grupie próbek zostaną określone poziomy ekspresji mRNA TNFα, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL4, IL-10 i IL-6. Całkowity RNA zostanie wyizolowany i poddany działaniu DNazy przy użyciu zestawu Qiagen 96 RNeasy® (Qiagen, Clifton Hill, Australia) zgodnie z instrukcjami producenta. Jakość próbek RNA zostanie zweryfikowana, przeprowadzona odwrotna transkrypcja i ilościowe oznaczenie cDNA metodą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu QuantiTect SYBR Green Master Mix (Qiagen) na ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Zostaną użyte specyficzne startery dla mRNA. Analiza krzywej dysocjacji potwierdzi specyficzność amplifikacji, a liczba kopii zostanie określona na podstawie krzywych wzorcowych plazmidu lub produktu PCR. Docelowe liczby kopii mRNA zostaną znormalizowane względem liczby kopii genu referencyjnego dla każdej próbki cDNA. Powyższe metody są już dostępne w laboratorium CIA w szpitalu Fremantle. Granica wykrywalności mRNA wynosi 3 pg/ml dla wszystkich cytokin

Analiza statystyczna: Zostaną przeprowadzone porównania między ekspresją mRNA w biopsjach endoskopowych pobranych w tygodniu 0 i 8 (lub w momencie odstawienia) w ramieniu leczonym takrolimusem i porównane między sobą oraz z tymi z ramienia kontrolnego placebo w tych samych punktach czasowych. Poziomy ekspresji mRNA będą skorelowane z endoskopowymi i histologicznymi ocenami stanu zapalnego. Różnice między grupami zostaną ocenione przy użyciu jednokierunkowej analizy ANOVA na danych przekształconych logarytmicznie. Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu Pakietu Statystycznego dla Nauk Społecznych (SPSS) wersja 17. Za istotność statystyczną przyjmuje się p<0,05 dla wszystkich analiz.