Tacrolimus rettale nel trattamento della proctite ulcerosa resistente

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) sono condizioni che durano tutta la vita, spesso diagnosticate tra i 15 ei 35 anni di età, che stanno aumentando di frequenza. Nei paesi sviluppati, la prevalenza di IBD era di circa 100-220/100.000 nel 2002. Più recentemente la prevalenza stimata di CD e UC negli Stati Uniti è rispettivamente di 201 e 238 per 100.000. Ciò indica più di 620.000 CD e 730.000 pazienti con UC solo negli Stati Uniti. È stato anche notato che l'incidenza dell'IBD è aumentata nelle minoranze etniche americane negli ultimi due decenni e si prevede che l'IBD, che in precedenza era considerata una "malattia caucasica", raggiungerà livelli comparabili in Asia come nei Paesi occidentali entro 10-15 anni. Uno dei maggiori costi nel trattamento delle IBD è la necessità di un ricovero ospedaliero. Questi sono diminuiti per i pazienti con CD a causa del crescente uso delle terapie biologiche, tuttavia, i ricoveri per CU sono raddoppiati negli ultimi 15 anni. L'IBD ora costa all'economia australiana di 22.000.000 di persone oltre $ 2,7 miliardi all'anno e questo è paragonabile in tutto il mondo occidentale.

Il tacrolimus e la ciclosporina sono inibitori classici della calcineurina e sono ampiamente utilizzati come farmaci immunosoppressori con risultati promettenti nella colite ulcerosa. La calcineurina, o proteina fosfatasi 2B (PP2B), è una proteina fosfatasi citosolica Ser/Thr espressa in modo ubiquitario, altamente conservata negli eucarioti. Ha la capacità di defosforilare un'ampia gamma di proteine ​​e può regolare l'espressione di interleuchina (IL)-2, IL-4 e interferone (IFN)γ, oltre a modulare l'attività di fattori di trascrizione come NF-κB. L'attività potenziata di NF-kB è ben descritta in CD e UC e induce l'espressione delle citochine proinfiammatorie IL-1β, IL-6 e TNFa. È principalmente attraverso la riduzione dei livelli di queste citochine che si può ottenere la remissione clinica.

L'efficacia del tacrolimus orale è stata esaminata nella gestione della MC e della CU resistenti ai farmaci. Sfortunatamente, la maggior parte di questi studi è stata aperta con un solo studio controllato randomizzato riportato in UC. Ciò ha dimostrato un miglioramento clinico a breve termine ma senza un aumento significativo del tasso di remissione, potenzialmente dovuto al basso numero di pazienti. Nonostante ciò, esistono numerosi studi in aperto sia nella CU che nel MC che suggeriscono l'efficacia a breve termine e con dati promettenti a lungo termine. L'evidenza suggerirebbe, tuttavia, che il livello minimo del sangue dovrebbe essere di almeno 10 ug/L per ottenere la migliore efficacia (intervallo terapeutico 5-20 ug/L), ma più alto è il livello minimo, più è probabile che un paziente soffra di un effetto avverso. Questi, purtroppo, possono essere numerosi e comprendono ipertensione, nausea e diarrea, anomalie ematologiche, insufficienza renale. Anche l'aumento del tasso di tumori della pelle è una preoccupazione, una preoccupazione supportata da studi sugli animali.

L'uso di tacrolimus topico è stato efficace nel trattamento dell'infiammazione periorale e perineale nei pazienti pediatrici con celiachia con risoluzione dei sintomi nel 75%. Anche il lavoro che ha esaminato la terapia topica perianale con tacrolimus nei pazienti adulti con celiachia ha dimostrato l'efficacia clinica e, sebbene il tacrolimus sia ben assorbito a livello transdermico, nel sangue sono stati rilevati solo bassi livelli minimi di tacrolimus. In questi studi preliminari, l'uso topico di tacrolimus è stato associato a pochissimi effetti collaterali. L'uso topico a lungo termine, come per le formulazioni orali, può essere associato ad un aumentato rischio di formazione di cancro della pelle. L'evidenza epidemiologica, tuttavia, suggerirebbe che il rischio è basso e localizzato sulla pelle esposta al sole trattata con tacrolimus.

Il recente studio pilota del nostro gruppo ha dimostrato che il 75% (6/8) dei pazienti con colite distale resistente ha risposto e ha ottenuto una remissione della malattia dopo 4 e 8 settimane di pomata rettale con tacrolimus8. Una dose da 0,3 a 0,5 mg/ml 3 ml due volte al giorno è stata identificata nella maggior parte dei pazienti per indurre la remissione. In questi pazienti i livelli minimi di tacrolimus sono stati assunti regolarmente ed erano non rilevabili (<1,5 μg/L) sub-terapeutici (<5 μg/L) o, al massimo, nel range terapeutico basso (range terapeutico 5-20 μg/L ). L'unguento è stato ben tollerato senza effetti avversi sistemici. L'uso della stessa preparazione rettale di tacrolimus in altri 8 pazienti è stato anche associato a una risposta clinica in 6 pazienti dopo 4 settimane di terapia.

L'efficacia del tacrolimus topico nella CU è ulteriormente supportata da uno studio pilota separato che ha esaminato il tacrolimus topico in pazienti con colite distale resistente. In questo studio è stato riscontrato un miglioramento clinico e istologico in 10 pazienti su 12 entro 4 settimane senza alcun effetto collaterale importante riportato e la preparazione è stata ben tollerata.

METODOLOGIA

Farmaco e fornitura dello studio: la preparazione dell'unguento rettale al tacrolimus sarà intrapresa nella rispettiva farmacia ospedaliera di ciascun centro. Guanti e mascherina devono essere indossati durante la preparazione. La concentrazione di tacrolimus nell'unguento deve essere di 0,5 mg⁄ml. Cinque millilitri di glicole propilenico verranno miscelati lentamente nella quantità desiderata di polvere di tacrolimus su una lastra di vetro pulita. A questo, 70 mL di paraffina liquida BP (LP) verranno gradualmente aggiunti mediante diluizione seriale e triturati fino a miscelazione omogenea. Questo processo sarà ripetuto con 125 mL di paraffin white soft BP (WSP). La crema risultante sarà confezionata in tubi ed etichettata. La preparazione sarà formulata utilizzando la base LP ⁄WSP per facilitare l'uso rettale.

Stabilità del farmaco: la crema scade dopo 30 giorni a temperatura ambiente o 90 giorni a 4-8°C

Somministrazione del farmaco in studio: un totale di 3 ml del farmaco in studio o del placebo verrà applicato per via rettale, tramite un applicatore, due volte al giorno dal paziente durante il periodo di 8 settimane. L'applicazione avverrà prima di andare a letto e dopo la colazione del mattino. Per i turnisti la domanda avverrà appena prima di andare a letto e dopo il primo pasto della giornata.

Programma di dosaggio:

1. Randomizzazione: i pazienti verranno assegnati in modo casuale in un rapporto 1:1 a ricevere il tacrolimus o il placebo.
2. Accecamento: i pazienti dello studio e gli investigatori clinici saranno all'oscuro della randomizzazione.

Terapia concomitante: la preparazione rettale verrà interrotta un giorno prima dell'inizio della sperimentazione. I pazienti continueranno con gli stessi farmaci orali che stavano assumendo all'inizio dello studio.

Visita di screening: tutti i pazienti firmeranno il consenso informato prima di qualsiasi raccolta di dati. Verranno registrati i dati demografici dei pazienti. Coltura e microscopia delle feci, pressione sanguigna (BP), emocromo completo (FBC), velocità di eritrosedimentazione (ESR), proteina C-reattiva (CRP), urea, elettroliti (U&E) e GFR saranno prelevati e misurati localmente in ciascun sito . I risultati di questi test verranno inviati via fax al sito centrale dell'ospedale di Fremantle entro 3 giorni dalla raccolta per la revisione. La calprotectina fecale sarà prelevata e conservata a -20°C. Questi campioni verranno inviati in lotti su ghiaccio secco ogni 3 mesi al sito centrale del Fremantle Hospital per l'analisi.

Entro 7 giorni prima della settimana 0 verrà eseguita una sigmoidoscopia flessibile. All'endoscopia verranno scattate due serie di foto, una distale (entro 15 cm dall'ano) e una prossimale (15-25 cm dall'ano). La regione che rappresenta il peggior livello di infiammazione verrà prelevata 2 biopsie da ciascuna regione per l'analisi istologica. Le biopsie saranno fissate e bloccate in ogni sito ospedaliero. Tutti i blocchi di paraffina verranno inviati all'ospedale di Fremantle. A seguire le foto per l'analisi istologica. Quattro ulteriori biopsie saranno prelevate da ciascuna regione per l'isolamento dell'RNA. Le biopsie di ciascuna regione verranno immediatamente poste in 2 provette etichettate 'prossimale' e 'distale' contenenti RNAlater e conservate a -80°C. Questi verranno quindi inviati in lotti su ghiaccio secco ogni 3 mesi al sito centrale del Fremantle Hospital per l'analisi. Verrà calcolato un punteggio Mayo completo per confermare la presenza di UC attiva (punteggio Mayo compreso tra 6 e 12 richiesto per l'inclusione).

Settimana 0: verrà calcolato un punteggio Mayo utilizzando i risultati endoscopici dello screening e il trattamento avviato. Basale IBDQ calcolato e BP misurata

Settimane 2 e 4: verrà calcolato un punteggio Mayo modificato, BP rilevata e FBC, ESR, CRP, U&E come descritto sopra e l'IBDQ valutato. La calprotectina fecale sarà prelevata e conservata a -200C. Verrà prelevato il sangue per il trogolo del tacrolimus, raccolto il siero e conservato a -20°C. Il siero verrà quindi inviato su ghiaccio secco al sito centrale presso il Fremantle Hospital per la valutazione entro 2 giorni dalla raccolta. Il monitor medico (CIA) del Fremantle Hospital esaminerà tutti i livelli minimi di tacrolimus per garantire la sicurezza del paziente.

Settimana 8 o ritiro: verrà eseguita una sigmoidoscopia flessibile ± 3 giorni della visita della settimana 8 (o al ritiro anticipato) e verrà calcolato un punteggio Mayo completo. Le foto e le biopsie saranno prese ed elaborate come dettagliato alla sigmoidoscopia di screening. FBC, U&E, VES, CRP, BP misurati di routine e calprotectina fecale come descritto sopra

Settimana 12: Telefonata di follow-up per valutare eventuali eventi avversi. Ogni campione istologico sarà valutato centralmente presso il Fremantle Hospital da un istopatologo gastroenterologico specializzato in cieco. Questi risultati saranno correlati con il punteggio endoscopico e le foto scattate durante l'endoscopia.

Ritiro anticipato dallo studio: i pazienti sono liberi di ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento. Se il paziente si ritira a causa della mancanza di efficacia della preparazione dello studio 4 o più settimane dopo la visita della settimana 0, sarà idoneo per l'uso in aperto dell'unguento topico al tacrolimus per 4 settimane. Sarà richiesta una sigmoidoscopia flessibile prima della somministrazione dell'unguento topico a base di tacrolimus. Le foto verranno scattate prima delle biopsie come descritto per le procedure della settimana 0 e 8. Dopo 2 settimane di terapia come descritto sopra verranno assunti di routine FBC, U&E, VES, CRP, BP misurati, livelli minimi di tacrolimus e calprotectina fecale. Questi pazienti saranno idonei per l'analisi per gli endpoint primari e secondari

Analisi ad interim: verrà effettuata un'analisi ad interim da parte di uno statistico e di un clinico indipendenti dopo che 20 pazienti hanno completato la visita di 8 settimane per confermare la sicurezza del farmaco e per valutare l'efficacia. Ciò sarà necessario prima di consentire la prosecuzione dello studio.

Livelli di espressione dell'mRNA: Biopsie (x4) prelevate da due regioni per il colon distale (entro 15 cm dall'ano e 15-25 cm dall'ano). Sarà stata annotata la regione contenente la peggiore infiammazione osservata all'esame endoscopico alle settimane 0 e 8 (o alla sospensione anticipata). Tutti i campioni saranno immediatamente collocati nell'RNA successivamente e conservati a -800°C prima del trasferimento su ghiaccio secco al sito centrale del Fremantle Hospital. I livelli di espressione di mRNA di TNFa, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL4, IL-10 e IL-6 saranno determinati su ciascun gruppo di campioni. L'RNA totale sarà isolato e trattato con DNasi usando il kit Qiagen 96 RNeasy® (Qiagen, Clifton Hill, Australia) secondo le istruzioni del produttore. Verrà verificata la qualità dei campioni di RNA, eseguita la trascrizione inversa e quantificato il cDNA mediante PCR in tempo reale utilizzando QuantiTect SYBR Green Master Mix (Qiagen) su ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Saranno utilizzati primer specifici per gli mRNA. L'analisi della curva di dissociazione confermerà la specificità dell'amplificazione e il numero di copie sarà determinato dalle curve standard del plasmide o del prodotto PCR. I numeri di copie dell'mRNA bersaglio saranno normalizzati rispetto al numero di copie del gene di riferimento per ciascun campione di cDNA. I metodi di cui sopra sono già disponibili nel laboratorio della CIA al Fremantle Hospital. Il limite di rilevamento dell'mRNA è di 3 pg/ml per tutte le citochine

Analisi statistica: verranno effettuati confronti tra l'espressione dell'mRNA nelle biopsie endoscopiche prelevate alle settimane 0 e 8 (o al momento della sospensione) nel braccio di trattamento con tacrolimus e confrontati tra loro e rispetto a quelli del braccio di controllo con placebo negli stessi punti temporali. I livelli di espressione dell'mRNA saranno correlati con i punteggi infiammatori endoscopici e istologici. Le differenze tra i gruppi saranno valutate utilizzando ANOVA unidirezionale su dati log-trasformati. L'analisi statistica sarà condotta utilizzando il pacchetto statistico per le scienze sociali (SPSS) versione 17. La significatività statistica è considerata come p<0,05 per tutte le analisi.