Imunofenotypizace a gen Xist v AML (Xist)

Akutní myeloidní leukémie (AML) je heterogenní onemocnění charakterizované klonální expanzí myeloidních progenitorů (blastů) v kostní dřeni a periferní krvi. s vysokou mortalitou a proměnlivou prognózou. AML je nejčastější akutní leukemie u dospělých, která představuje ~ 80 procent případů v této skupině. Ve Spojených státech (USA) se každý rok objeví přibližně 19 520 nových případů AML a 10 670 úmrtí na AML. V Egyptě byla incidence AML 0,96 % u mužů a 1,14 % u žen podle výsledků Národního programu evidence obyvatel Egypta (2008-2011). Diagnostika AML na základě morfologické diagnózy s proliferací blastových buněk ≥ 20 % buněk kostní dřeně, průtokovou cytometrickou imunofenotypizací a cytogenetickými abnormalitami.

Imunofenotypizace pomocí průtokové cytometrie zahrnuje další rychlou techniku ​​k predikci výsledku u AML, i když jen málo markerů je dosud zavedeno jako prognostické faktory v klinické rutinní diagnostice, a to navzdory skutečnosti, že ke zlepšení rozhodnutí o léčbě u pacientů s AML jsou zapotřebí nové a rychle dostupné markery. To platí ještě více, protože léčba u pacientů s AML musí být zahájena ihned po diagnóze. AML blasty exprimují antigeny nacházející se také na zdravých nezralých myeloidních buňkách, včetně běžných diferenciačních (CD) markerů CD13, CD33 a CD34. Jiné buněčné markery jsou exprimovány v závislosti na morfologickém podtypu AML a stádiu diferenciačního bloku, jako jsou monocytární diferenciační markery (CD4, CD14, CD11b, CD11c, CD64, CD36), erytroidní (CD36, CD71) a megakaryocytární markery (CD41a a CD61) .

Nenáhodné chromozomální abnormality (např. delece, translokace) jsou identifikovány u přibližně 52 % všech dospělých pacientů s primární AML a byly dlouho uznávány jako genetické události, které způsobují a podporují toto onemocnění. Některé cytogenetické abnormality, včetně t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q12) a inv(16)(p13.1;q22) jsou spojeny s delší remisí a přežitím, zatímco změny chromozomů 5, 7, komplexní karyotyp (popsané jako >3 chromozomální abnormality) a 11q23 jsou spojeny se špatnou odpovědí na terapii a kratším celkovým přežitím.

Několik studií uvádí korelace aberantně exprimovaných markerů s klinickým výsledkem u AML. Například exprese CD7 a CD25 byla spojena se špatnou prognózou u AML s normálním karyotypem (NK). Receptor IL3 alfa (CD123) je nadměrně exprimován u 45 % pacientů s AML a tato vyšší exprese byla také spojena se špatným výsledkem a korelovala s mutacemi v genu tyrozinkinázového receptoru podobného fms (FLT3). Konzistentní antigenní profil s vysokou expresí CD33 byl také spojen s AML s mutovaným nukleofosminem (NPM1). Výsledky Lo-Coco et al., (2015) naznačují, že imunofenotypy spojené s CD34/25/123/99+ve leukémií (LAIP) jsou striktně spojeny s FLT3-ITD pozitivními buňkami. Tato identifikace pomocí multiparametrické průtokové cytometrie při diagnóze imunofenotypového otisku prstu spojeného s těmito subklony je novým a zjednodušeným nástrojem se zlepšenou citlivostí k rozluštění těchto klonů a umožňuje stratifikaci pacienta a léčbu přizpůsobenou riziku s potenciálním dopadem na výsledek onemocnění.

V současné době není etiologické agens a patogeneze AML zcela jasné, pouze několik případů AML lze přesně klasifikovat pomocí tradiční buněčné morfologické klasifikace. Je tedy velmi obtížné posoudit stav onemocnění a předpovědět prognózu. Nesprávná exprese specifických genů je běžným nálezem u AML a může indukovat klinicky relevantní biologické podskupiny. V důsledku toho identifikace nových biomarkerů, které by mohly předpovídat výsledek nebo vést volbu léčby, přispěje více ke klinické léčbě AML.

Aneuploidie chromozomu X byly dlouho spojovány s lidskými rakovinami, ale kauzalita nebyla prokázána. U savců je inaktivace chromozomu X (XCI) spouštěna X-inaktivním specifickým transkriptem (Xist) RNA k vyrovnání genové exprese mezi pohlavími. U lidí je jeden chromozom X inaktivován (Xi) v každé ženské buňce, aby se dosáhlo transkripční rovnováhy. X-vázané inaktivační centrum (XIC) je zodpovědné za zahájení X inaktivace. Přesná velikost XIC není jasná, ale zahrnuje Xistgene na Xq13.2. To kóduje velkou nekódující RNA, která je zpočátku exprimována na obou chromozomech X, než se zastaví exprese na aktivním X a stane se upregulovanou na X, který se má inaktivovat. Produkt Xist RNA pokrývá budoucí chromozom Xi a šíří se z XIC.

X-inaktivní specifický transkript RNA byl jednou z prvních dlouhých nekódujících RNA (lncRNA), které byly objeveny na počátku 90. let, deset let předtím, než projekt Human Genome Project (HGP) odhalil, že velká většina našeho genomu odpovídá za nekódující sekvence. Xist je 19 kb, sestřižený, nepřeložený regulační transkript, který pokrývá chromozom X, ze kterého je exprimován v cis. Xist RNA je hlavním regulátorem XCI, epigenetického procesu, který vyrovnává dávkování genů vázaných na X mezi samicemi (XX) a samci (XY) savců. Delece genu Xist vede ke zkreslené inaktivaci chromozomu X divokého typu, což naznačuje, že tento lokus je nezbytný pro umlčení genu.

Rané transgenní studie také odhalily dva klíčové rysy Xistovy funkce. Za prvé, schopnost Xist RNA spouštět umlčování genů je přísně závislá na vývojovém kontextu. Za druhé, Xist má různé úkoly, jako je cis-lokalizace na chromozom, ze kterého je exprimován, a schopnost spouštět umlčení genu, a tyto úkoly jsou zprostředkovány geneticky nezávislými doménami RNA. Navíc nevhodné umlčování lidského Xist vede ke kvalitativně aberantním kmenovým buňkám. Zatímco Xist byl rozsáhle zkoumán v buněčné kultuře, in vivo studie byly omezené, avšak žádná z těchto studií nebyla provedena u lidí.

V některých případech byla pozorována nesprávná lokalizace Xist RNA a sporadická reaktivace Xi. Například jedna studie na buněčné linii rakoviny vaječníků ukázala narušení exprese Xist a potenciální reaktivaci genu membránového palmitoylovaného proteinu-1 (MPP1) (p55). Předchozí studie ukázala, že neaktivní chromozom X je geneticky nestabilní u rakoviny, protože tato studie uvádí vyšší míru mutací na neaktivním X ve srovnání se zbytkem genomu.

Delece Xist v krevním kompartmentu myší prokázala, že u mutantních samic se vyvinul vysoce agresivní myeloproliferativní novotvar a myelodysplastický syndrom (smíšený MPN/MDS) se 100% penetrancí. Mezi významné složky onemocnění patří primární myelofibróza, leukémie, histiocytární sarkom a vaskulitida. Zjistili, že proliferativní a dysplastické změny byly přítomny u všech typů krvetvorných buněk. Také Xist-deficientní hematopoetické kmenové buňky (HSC) vykazovaly aberantní zrání a ztrátu dlouhodobých HSC závislou na věku.

Jejich studie naznačuje, že lidské hematologické rakoviny mohou být důsledkem předávkování X, buď ze ztráty Xist na Xi, nebo z duplikace Xa. A navrhli, že karcinogeneze je řízena řadou změn vyskytujících se v HSC a dále akumulovaných ve zralých hematopoetických buňkách. Tyto změny jsou iniciovány ztrátou Xist, která vede k progresivní reaktivaci X, která následně vyvolává kaskádu nepříznivých změn v celém genomu, které zahrnují dysregulaci genů zapojených do replikace DNA, segregace chromozomů, kontrolní body buněčného cyklu a hematopoézu. Selhání zrání HSC a ztráta dlouhodobého HSC ve dřeni progresivně posouvají hematopoézu do extramedulárních míst, což vede k extradřeňové hematopoéze (EMH), čímž kauzálně spojuje chromozom X s rakovinou u myší. Došli tedy k závěru, že Xist RNA je nejen nutná k udržení XCI, ale také potlačuje rakovinu in vivo.

Objevující se role aberantního dávkování genů u nemocí, ať už chromozomů X nebo autozomů, s sebou přináší možnou aplikaci léků, které mají dopad na epigenetické regulátory v potenciálních terapeutických strategiích.

K dnešnímu dni neexistují žádné publikované studie na lidech o genu Xist a jeho vztahu k imunofenotypizaci u pacientů s AML. Bude to tedy první studie navržená tak, aby vysvětlila jeho neprozkoumanou cestu u AML a odhalila jeho prognostickou roli a imunofenotypovou asociaci.